本文研究了利用合成聚乙二醇(PEG)水凝胶作为基材组装人类神经类器官的方法,并与传统的Matrigel表面进行了比较。研究发现,在PEG水凝胶上形成的平面神经类器官具有更高的神经元多样性、神经血管和神经炎症基因表达,同时降低了组织变异性。这种组装方法采用开放式细胞培养,使得组织足够透明,便于连续成像。此外,平面神经类器官中的功能性小胶质细胞能够响应炎症刺激和抗炎药物,表明它们具有潜在的生理相关性。因此,PEG水凝胶神经类器官可作为研究神经炎症的体外模型,为神经科学研究提供了新的工具。
本文旨在建立一种开放式细胞培养系统,利用人诱导多能干细胞生成平面神经类器官,以用于疾病建模。将 Matrigel 和 PEG 水凝胶作为培养和扩增神经类器官的基质,结果发现,与 Matrigel 表面的神经类器官相比,PEG 水凝胶表面的神经类器官形态扁平,神经血管标记更为丰富。研究结果表明,平面神经器官组织可用作神经炎症的生理相关体外模型。为了组装人类神经类器官,研究人员采用了合成聚乙二醇(PEG)水凝胶作为基材,具体步骤如下:
首先,从人诱导多能干细胞(iPSCs)出发,利用Essential 8(E8)培养基进行细胞培养,这种培养基为iPSCs的生长和增殖提供了全面支持。
接着,将iPSC源的前体细胞种植在PEG水凝胶表面。这些细胞在适宜的培养条件下,逐渐形成了平面神经类器官。与传统的Matrigel表面相比,PEG水凝胶上的神经类器官展现出更高的神经元多样性和神经血管标记物的表达。
为了进一步研究这些神经类器官的特性,研究人员进行了免疫荧光成像,检测了如SOX2、βIII-tubulin、GFAP等神经标记蛋白,以及人类大脑皮层神经标记蛋白CUX1的表达情况。
此外,通过酶联免疫吸附实验(ELISA),他们还测量了神经组织分泌的脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白水平,以评估其分泌功能。
1、细胞种植:将人诱导多能干细胞(iPSC)来源的内皮细胞(iPSC-ECs)、周细胞(iPSC-PCs)、神经祖细胞(iPSC-NPCs)和小胶质细胞(iPSC-MG)种植在合成聚乙二醇(PEG)水凝胶表面上。
3、培养条件:在PEG水凝胶表面上,神经组织在无血清和无抗生素的生长培养基中培养28天。这种培养环境支持神经组织的生长和成熟,形成平面神经类器官。
4、表征:使用各种技术表征形成的PNOs,包括共聚焦显微镜成像来可视化神经组织的结构和组成。此外,还进行基因表达分析,如RNA-seq,以评估PNOs中神经、血管和神经炎症基因的表达。
5、功能分析:进行功能研究,如酶联免疫吸附实验(ELISA),以评估PNOs对脂多糖(LPS)等刺激物的反应,以及抗炎药物在调节神经炎症反应中的有效性。
图1 示意图展示了在Matrigel或PEG水凝胶表面上培养神经组织的过程:(a)在Matrigel或PEG水凝胶表面上培养神经组织的示意图。通过光聚合交联PEG分子和基质金属蛋白酶(MMP)可降解肽来形成PEG水凝胶,并包括一个悬挂的细胞粘附肽。将人诱导多能干细胞(iPSCs)来源的前体细胞在血管生成96孔板中与Matrigel和/或PEG水凝胶表面共同培养。内皮细胞(ECs)和周细胞(PCs)在第0天种植,接着在第7天种植神经祖细胞(NPCs),并在第12天种植小胶质细胞(MGs)。在血管生成96孔板中培养的类器官的明场图像显示了在PEG上形成的组织的平面形态,以及在Matrigel上生长的组织的网状形态(b和c)。在Matrigel(顶部)或PEG水凝胶(底部)表面上生长的神经组织的3D共聚焦图像(比例尺为500和100 µm)。在PEG水凝胶表面上的组织显示出平面形态,而在Matrigel表面上的组织显示出网状形态。
平面神经类器官(PNOs)的血管组装体表征是一个综合过程。它始于在聚乙二醇(PEG)水凝胶上种植人诱导多能干细胞来源的内皮细胞和周细胞,形成血管组装体。随后,通过特定培养条件,促进血管网络的发育和成熟。采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术,可高分辨率地可视化血管结构,揭示其密度、互联程度和空间布局。定量分析这些特征,可全面理解血管在神经组织发育和功能中的关键作用。这一过程不仅深化了对神经血管系统的认识,还为体外研究提供了重要工具。
图2 神经类器官的血管组织表征。共聚焦图像显示了在Matrigel(a和b)或PEG水凝胶(c和d)上形成的组织中的CD31+内皮细胞(绿色)。(e) 平面神经类器官中CD31血管网络的三维重建。与在Matrigel上形成的组织相比,PEG水凝胶上的平面神经类器官显示出更密集且相互连接的血管网络形成。血管内皮生长因子(VEGF)pazopanib(PAZ)对在Matrigel(e和f)或PEG水凝胶(g和h)上形成的神经组织中的CD31+血管网络(绿色)有显著影响。(i) 从在Matrigel(MTG)或PEG水凝胶上形成的神经类器官的培养样品中测量VEGF蛋白。比例尺为100μm。
利用免疫荧光染色技术,研究者可视化并表征了平面神经类器官(PNOs)中神经元和星形胶质细胞的标记蛋白表达,如βIII-tubulin和GFAP。通过比较不同培养模型中的细胞组成,揭示了PNOs的神经组织多样性。同时,功能研究如测量BDNF的分泌,进一步了解了PNOs内的神经营养支持和信号传导。
图3 神经类器官中神经标记蛋白的表征。Matrigel表面(a)和PEG水凝胶表面(f)形成的神经组织的免疫荧光染色。用针对神经标记蛋白SOX2(c和h)、βIII-tubulin(d和i)和GFAP(e和j)的抗体标记细胞核的分布(b和g)。比例尺为100μm。用针对人脑皮质神经标记蛋白CUX1(绿色;k和l)的抗体对神经类器官进行免疫荧光染色。比例尺为100μm。(m)测量由神经组织分泌的脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白。
平面神经类器官(PNOs)中突触标记物和小胶质细胞表型的表征涉及对突触蛋白(如SNAP-25和PSD-95)的染色,以评估突触结构和神经递质释放。此外,使用针对小胶质细胞标记物(如IBA1)的免疫荧光染色有助于分析小胶质细胞的存在和形态,揭示它们在PNOs中的神经炎症反应和神经支持作用。
图4 神经类器官中突触标记蛋白的特征。突触前标记蛋白(a 和 c)SNAP-25(绿色)和突触后标记蛋白(b 和 d)PSD-95(红色)的免疫荧光染色。比例尺 50 μm。(e)神经组织培养样本中谷氨酸的测量结果。
图5 神经类器官中小胶质细胞表型的特征。三维神经组织的共聚焦图像显示存在小胶质细胞标记蛋白 IBA1(红色)和神经标记βIII-tubulin(绿色;a 和 c)。分段小胶质细胞的三维重建显示了组织内的分支形态(b 和 d)。比例尺100μm。
在比较平面神经类器官(PNOs)与传统脑类器官聚集体之间的基因表达时,发现了一些显著的区别。PNOs,这些在聚乙二醇(PEG)水凝胶上形成的类器官,表现出更高水平的神经标记物,如CD-31、βIII-tubulin、GFAP和IBA1,这与传统脑类器官相比是一个显著的特点。通过RNA-seq分析,我们观察到PNOs中有2456个基因显著上调,而传统脑类器官中则有1297个基因上调。此外,PNOs还显示出特定神经元细胞类型相关基因的上调,包括GABA能和谷氨酸能神经元以及突触基因。这些发现共同表明,与传统的脑类器官聚集体相比,PNOs在神经多样性和基因表达谱方面展现出更高的潜力。
图6 平面神经类器官与传统脑类器官的基因表达与基因本体分析:(a) 显微镜图像展示了在传统Matrigel悬浮液中(顶部)或在PEG水凝胶表面上(底部)组装的神经类器官的形态特征,(b) 在Matrigel悬浮液中形成的传统脑类器官与在PEG水凝胶上形成的平面神经类器官的全局基因表达模式,以及(c) 与神经组织生长相关的生物过程的基因本体分析。
图7 分析在PEG水凝胶上形成的平面神经类器官与传统Matrigel悬浮液中形成的脑类器官中(a)前脑、(b)中脑和(c)后脑的差异表达基因。差异表达分析的倍数变化(Log2)与差异表达分析的p值的-Log10值作图。在图。
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