目前,组织特异性胎儿干细胞和原代类器官的分离与衍生主要依赖于终止妊娠的样本,这限制了胎儿发育和先天性疾病的产前研究。因此,需要构建新的患者特异性体外模型。
羊水(AF)是多个发育器官的细胞来源,通过单细胞分析,研究者表征了人类AF中的细胞特性,并成功分离出胎儿胃肠道、肾脏和肺部的活上皮干/祖细胞。这些细胞在培养后能形成克隆上皮类器官,表现出小肠、肾小管和肺的特征。AF类器官具有其起源组织的转录组学、蛋白质表达和功能特性。他们还从先天性膈疝胎儿的AF和气管液细胞中获得了肺类器官,这些类器官再现了疾病的一些特征。AF类器官的衍生时间与产前干预相一致,有望在临床相关发育阶段研究针对胎儿的个性化治疗工具和再生医学策略。
1. 采集人类羊膜液和气管液样本:研究团队从孕妇的羊膜液和新生儿的气管液中采集样本,用于分离和培养胎儿干细胞。
2. 单细胞测序技术:利用单细胞测序技术对羊膜液和气管液中的细胞进行分析,以识别和分离出具有干细胞特性的细胞群。
3. 建立原代胎儿上皮类器官:通过将分离的胎儿干细胞培养在特定的培养基中,形成原代胎儿上皮类器官,如胎儿肺、胃等。
4. 分子生物学分析:对形成的类器官进行分子生物学分析,包括基因表达分析、蛋白质表达分析等,以了解其特性和功能。
通过这些研究方法,研究团队成功地从人类羊膜液和气管液中分离出胎儿干细胞,并建立了原代胎儿上皮类器官,为研究胎儿发育和先天疾病提供了新的研究模型和方法。
在这项研究中,研究人员对人类的羊水(AF)进行了单细胞图谱分析,以研究组织特异性胎儿上皮祖细胞的存在。他们从12次妊娠中收集了AF样本,并使用荧光激活细胞分选(FACS)技术分离出有活力的核细胞。随后,他们进行了3单细胞RNA测序(scRNA-seq)并使用Seurat v.4生成了UMAP。他们利用SingleR软件根据人类主要细胞图谱数据自动注释上皮簇,并通过泛上皮标记基因的表达证实了这一注释。为了验证蛋白质,他们使用流式细胞术确认了大多数有活力的AF细胞中存在上皮细胞粘附分子。
图1 单细胞 AF 含量分析。a,左上图:羊水采样的图形表示。左下图:FACS图展示了用于收集活细胞部分的分选策略,这些细胞PI呈阴性,Hoechst呈阳性。中间图:UMAP展示了在妊娠中期和晚期获取的多个患者羊水样本的内容(n=12个生物学独立的羊水样本,跨越15-34个孕期;经过筛选后检查了33,934个细胞,分布在11个测序通道上)。橙色突出显示的是上皮簇,这是通过SingleR细胞标记包,使用人类原代细胞图谱数据集作为参考来识别的。右图:小提琴图显示了泛上皮特异性基因EPCAM、CDH1(ECAD)、KRT8、KRT10、KRT17和KRT19的表达水平(数据以每百万归一化计数(CPM)表示)。b,UMAPs显示了在上皮簇中选定上皮标记物的表达情况,这些上皮簇是在a中识别的。c,流式细胞术分析EpCAM(n=58,964个细胞)和ECAD(CDH1,n=38,389个细胞)在羊水活细胞分选中的表达情况;灰色代表未染色对照(n=34,045个细胞)。d,重新计算的UMAP,展示了在a中识别出的上皮簇,通过scGSEA将细胞归因于三种组织。e,对d中识别的细胞进行评分,以评估其是否含有适当的祖细胞相关基因。具有正评分的细胞在重新计算的该组织细胞UMAP中突出显示。分数也以小提琴图的形式绘制,确定了祖细胞的不同群体,阳性分数的阈值以红色标出。
在研究中,生成初级胎儿上皮人类羊水类器官(AFOs)涉及了几个关键步骤。首先,研究人员将来自人类羊水的活细胞接种在Matrigel液滴中,并在不含组织特异性信号的一般上皮培养基中进行培养。两周内,单个细胞开始增殖并自我组织形成3D类器官。接着,为了建立克隆系,研究人员挑选出单个AFOs,将其解离成单个细胞,并重新接种。这一过程使得研究人员能够从原始羊水样本中推导出多个克隆系。这些推导出的AFOs呈现出多种形态,能够扩增至第20代,并成功进行冷冻保存,显示出自我更新和长期培养的能力。此外,在89.7%的羊水样本中观察到类器官形成,平均形成效率为0.011%,这表明细胞具有形成类器官并自我组织成复杂结构的能力。通过遵循这些步骤,研究人员成功地从收集到的样本中生成了初级胎儿上皮人类羊水类器官(AFOs)。
图2 生成原代胎儿上皮 AFOs。a,相衬图像显示来自三维培养的活羊水细胞的类器官形成,在第14天观察到不同形态的类器官(比例尺,200μm)。b,上图:AFOs在分离时(传代次数P0)的形成效率(每个活细胞的类器官数)和大小(类器官面积)(效率图n=26个独立的羊水样本,面积图n=197个类器官;两者均为中位数和四分位数)。下图:代表不同孕龄(GA)下类器官形成效率(每个活细胞的类器官数)的线性回归图。颜色和大小代表每个样本产生的总类器官数;虚线,标准误(s.e.m.)以灰色显示。c,相衬图像显示了在P1、P5、P10和P20扩张过程中观察到的多个克隆AFO形态(比例尺,200μm)。d,在7-15天的培养过程中,每平方毫米形成的类器官数量在十个传代次数中进行了量化(n≥11个类器官,来自n=19个独立的羊水样本;中位数和四分位数;单因素方差分析(ANOVA)与多重比较)。e,两种观察到的类器官表型(紧凑型和囊性)的X射线μm。f,免疫荧光染色显示P3的AFOs中增殖标志物Ki67的表达和缺乏裂解型半胱天冬酶3凋亡细胞,细胞核用Hoechst复染(比例尺,50μm)。g,免疫荧光染色显示P3的AFOs表达上皮标志物EpCAM、ECAD和泛细胞角蛋白,同时缺乏间充质标志物PDGFRɑ的表达。免疫荧光染色还显示了AFO的极化,其特征是上皮紧密连接ZO-1存在于管腔表面,而基底外侧存在ITGβ4。鬼笔环肽复染强调了肌动蛋白丝(F-ACT)(比例尺,50μm)。h,无监督的主成分分析(PCA)图显示AFOs(三角形)形成了三个主要集群(来自n=23个羊水样本的n=121个类器官系)。这些集群与来自初级胎儿组织衍生的对照类器官(圆圈,n=20)存在共定位,这些对照类器官是从肺(青色)、小肠(紫色)、肾(绿色)、胎盘()、膀胱(橙色)和胃(红色)样本中产生的。i,从三个组织特性的代表性AFOs中产生的单细胞RNA测序(scRNA-seq)UMAP。通过SingleR细胞标记包识别的上皮细胞以橙色突出显示;KAFOs(1467个细胞,n=5名患者)、LAFOs(1966个细胞,n=4名患者)和SiAFOs(1576个细胞,n=2名患者)均显示在图中。
在研究小肠羊水类器官(SiAFOs)的特性和成熟过程中,研究者们进行了多项重要步骤。首先,他们通过在小肠特异性培养基中培养SiAFOs长达14天,成功诱导其成熟。在这一过程中,类器官呈现出更加明显的出芽结构,类似于小肠隐窝的组织形态。接着,利用免疫荧光染色技术,研究者们评估了成熟SiAFOs中特定标记物的表达情况,包括用于识别肠内分泌细胞的嗜铬粒蛋白A(CHGA)和用于标记杯状细胞的粘蛋白2(MUC2)。随后,通过定量逆转录PCR(RT-qPCR)分析,结合特定处理,研究者们深入研究了成熟SiAFOs的基因表达谱,揭示了成熟过程中分子层面的变化。此外,功能性实验也被用来评估小肠刷状缘酶(如二肽基肽酶IV和糖苷酶)的消化活性,以检验成熟SiAFOs的功能能力。最后,通过肠道环状形成实验,研究者们探讨了SiAFOs在组织工程方面的潜力,观察了类似肠道结构的管状出芽结构的形成情况。
图3 小肠 AFO 的特征和成熟。a,相衬图像描绘了SiAFO的扩张(比例尺,200 μm)。EdU检测显示增殖细胞定位于隐窝样结构底部(比例尺,50 μm)。b,RNA-seq散点图显示SiAFO中存在小肠标志物(n=2个独立生物样本,n=23条扩张线条成熟线个对照胎儿组织来源的小肠类器官)。c,用肠干细胞标志物OLFM4、肠细胞标志物KRT20和ITGβ4进行免疫荧光染色。溶菌酶细胞(LYZ)、脂肪酸结合蛋白1(FABP1)和E钙粘蛋白(ECAD)染色突出了杯状细胞和肠细胞(比例尺,50 μm)。d,SiAFO中OLFM4、LYZ和EdU的量化。e,扩展中代表性SiAFO的注释scRNA-seq UMAP(灰色;1,576个细胞,n=3个类器官线)和成熟中代表性SiAFO的注释scRNA-seq UMAP(橙色;1,666个细胞,n=3个类器官线)。f,成熟的SiAFO显示出出芽形态(比例尺,200 μm)。免疫荧光染色显示铬粒蛋白A(CHGA)阳性的内分泌细胞和粘蛋白2(MUC2)阳性的分泌细胞。用鬼笔环肽(F-ACT)和Hoechst复染显示类器官的管腔和细胞核(比例尺,50 μm)。g,二肽基肽酶IV活性的功能评估。h,二糖酶活性的功能评估。i,j,示意图(使用BioRender创建)(i)和相衬图像(j,顶部)展示了SiAFO环的自我组装和压缩(比例尺,插图中的200 μm、1 mm和500 μm;来自两个AFs的8个环)。环的相对周长随时间变化的量化。MicroCT 3D重构和整个SiAFO环的横截面描绘了管腔结构(j,底部)(比例尺,50 μm)。L,管腔。k,SiAFO环具有管腔和KRT20阳性的肠细胞,ITGβ4强调基底侧以及CHGA阳性的内分泌细胞。图中展示了SiAFO环中的LYZ阳性细胞、ZO-1阳性紧密连接、FABP1阳性肠细胞和MUC2分泌细胞,在隐窝样区域观察到增殖的Ki6阳性细胞(外部侧)(比例尺,50 μm)。CT,对照;PBS,磷酸盐缓冲液。
在研究中,对肾脏小管羊水类器官(KAFOs)的表征和分化涉及了多个关键步骤。首先,KAFOs经过长期培养,以支持其生长和发育,并通过相相衬图像监测其扩张和形态变化。其次,利用免疫荧光染色技术,标记了KAFOs中的增殖标志物(如Ki67),以揭示细胞活动和增殖情况。接着,通过批量RNA-seq分析,评估了KAFOs中广泛存在的肾脏标志物,有助于识别与肾脏发育和功能相关的关键基因表达。此外,免疫荧光染色还用于验证KAFOs中肾小体祖细胞标志物(如PAX8和LHX1)、远端小管/集合管标志物(如GATA3)、近端小管标志物(如LTL)以及其他指示肾脏上皮特性的标志物的存在。最后,通过功能测试(如菊粉通透性测定),评估了KAFOs的功能特性,这有助于了解类器官的屏障功能和通透性。通过这些表征和分化过。
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