【中西合璧】基于海马α7nAChR/NF-kB信号通路的耳迷走神经刺激在慢性不可预测温和应激模型老鼠的抗抑郁作用机制
【摘要】背景:应激诱导的神经炎症被认为在抑郁症的发病机制中起关键作用。经皮耳迷走神经刺激(TAVNS)是治疗抑郁症患者的一种相对非侵入性的替代疗法。迷走神经的抗炎信号是由α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)介导的,而海马区是α7nAChR分布最多的区域,负责调节情绪。在这里,我们通过纯合子α7nAChR(α7nAChR,−/−)基因敲除和α7nAChR拮抗剂(甲基乌头碱,MLA),研究了α7nAChR介导的海马神经炎症在TAVNS抗抑郁效应中的作用。
方法:随机分为对照组、模型组、TAVNS组、α7nAChR(−/−)+TAVNS组、海马(Hi)MLA+TAVNS组、海马生理盐水+TAVNS组。除对照组外,我们采用慢性不可预测性温和应激(CUMS)方法42天建立抑郁模型大鼠。造模成功后,除对照组和模型组,其余组大鼠均给予耳甲迷走神经电针刺激,频率2/15 Hz,电流2 mA,30min/d,持续21d。在基础状态、造模后和TAVNS干预后进行行为学测试,包括蔗糖偏好试验(SPT)、旷场试验(OFT)和强迫游泳试验(FST)。这些测试被广泛用于评估大鼠的抑郁样行为。实验结束后取材,检测α7nAChR、NF-KB p65、IL-1β的表达及小胶质细胞的形态。
结果:模型组大鼠抑郁行为和海马神经炎症表现为α7nAChR表达下调,NF-KB p65和IL-1β表达上调,小胶质细胞形态呈阿米巴样活化状态。电刺激可明显逆转上述现象,但对α7nAChR(−/−)大鼠和海马MLA大鼠无明显改善作用。
重度抑郁障碍(MDD)是一种以情绪低落、快感缺乏、精力减退、思虑过多、认知障碍、植物性症状和试图为特征的高度普遍的心理健康状况。流行病学研究表明,全世界抑郁症患者总数估计约为3.5亿,这是全球致残的主要原因,全球患病率为2.6-5.9%。根据全球预测,到2030年,MDD将成为所有健康状况负担的单一主要原因。尽管可用的药物治疗方法越来越多,但据估计,约有30%-60%的患者对现有治疗无效,并与胃肠道反应、肝脏毒性和其他副作用有关。而约40%的患者在停药后仍有症状,10年内抑郁症的复发率为85%。因此,开发包括生物电子医学在内的更有效的非药物治疗方案至关重要。
迷走神经是第十对脑神经,它主要是感觉神经,本质上是将生物反馈传递给大脑。2005年,美国食品和药物管理局批准迷走神经刺激(VNS)用于难治性MDD患者。值得注意的是,VNS产生全身性抗炎效应,这可能是其对抗抑郁药物无效的患者有效的一个重要原因。然而,VNS需要手术,并受到术后并发症的限制,如呼吸困难、咽炎等。神经解剖学研究表明,迷走神经在体表的唯一分支是迷走神经耳支(ABVN),主要分布于外耳道和耳甲(耳甲艇和耳甲腔),耳甲艇仅由迷走神经耳支供应。经皮耳迷走神经刺激(TAVNS)作为一种很有前途的电疗方法,已被用于抑郁症的治疗。临床研究表明,TAVNS能显著提高非手术抑郁症患者的汉密尔顿抑郁量表(HAMD)和抑郁自评量表评分,临床疗效与迷走神经刺激相似。TAVNS经常用于MDD的治疗,特别用于残留症状。我们团队以前的研究表明,TAVNS的抗抑郁作用是通过孤束核-边缘叶-脑的默认网络介导的,而海马区是边缘叶的重要组成部分,海马区的异常与抑郁的因果有关联。但其在大脑中的潜在分子机制尚未完全阐明。
大量证据表明,神经炎症与抑郁症之间存在密切联系,而以脑内炎症细胞因子过度产生为特征的应激性神经炎症是抑郁症的重要发病机制。临床前研究还表明,慢性应激可导致脑内天然免疫系统的激活,而炎性细胞因子(如IL-1β)的增加可导致动物的抑郁行为。因此,可以推断,抗炎治疗可能是一种有前途的新选择。
研究表明,迷走神经可以作为中枢神经系统(CNS)和免疫系统之间的桥梁,在调节炎症方面发挥重要作用。我们先前的研究结果表明,耳迷走神经刺激能显著改善慢性坐骨神经挤压损伤模型大鼠的抑郁样行为和疼痛强度,并减少血浆、下丘脑和海马区TNF-α的释放。此外,我们还发现,迷走神经切断后或注射α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)拮抗剂后,TAVNS不能抑制内毒素诱导的TNF-α和NF-KB p65,这表明TAVNS可以通过α7nAChR介导的胆碱能抗炎途径改善内毒素诱导的炎症反应。
α7nAChR是一种主要表达于中枢神经系统小胶质细胞的亲离子受体,被认为在广泛的精神和神经疾病中发挥作用,并被细胞危险信号激活,如NF-KB。TAVNS在脾、肠、脑和炎症之间的关系中起着重要作用。α7nAChR介导迷走神经抗炎信号,并参与调节小胶质细胞激活的中枢胆碱能通路。此外,海马区是α7nAChR调节CUMS大鼠应激行为或情绪反应的重要部位。因此,我们试图了解TAVNS是否可以改善暴露于CUMS的大鼠的行为缺陷和减少神经炎症,以及这种基于抗炎的抗抑郁药作用是否通过调节α7nAChR来实现的。具体地说,我们检测了包括快感缺失、探索和运动活动在内的时间点的行为,通过纯合子α7nAChR(−/−)基因敲除大鼠。检测了收集的海马区α7nAChR和相关的神经炎性标志物(小胶质细胞、NF-KB p65、磷酸化的NF-KB p65、IL-1β)。
雄性SD大鼠,6周龄(200±20g,n=60)来自军事医学科学院实验动物中心(北京),纯合子α7nAChR(−/−)基因敲除大鼠,6周龄(200±2 0g,n=10)来自赛业生物科技公司(广州)。所有大鼠被安置在20-25℃,湿度为55±2%的受控环境中,保持在12h/12h的光/暗循环下的安静状态,并自由获取食物和水(除非有指示)。所有操作均经中国医学科学院针灸研究所动物保护与使用委员会(许可证号:D2019-02-11-3)。此外,所有动物实验都遵循指南,并根据美国国立卫生研究院关于照顾和使用实验动物的指南进行。由于雌激素对应激的保护作用,本研究只选择雄性大鼠。暴露于CUMS的大鼠分别被安置在不同的笼子中进行社会隔离,对照组每笼5只。
实验设计:SD大鼠适应性饲养7d后,随机分为对照组、模型组、TAVNS组、海马MLA+TAVNS组和海马生理盐水+TAVNS组。α7nAChR(−/−)+TAVNS组、海马α7nAChR拮抗剂+TAVNS组、海马生理盐水+TAVNS组造模及干预方法相同,每组10只。造模期间除对照组外,其余各组均接受为期42天的社会隔离和CUMS训练。造模成功后,Hi MLA+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组在背侧海马区埋管。两组大鼠埋管后静息3d,在CUMS程序前1h,两组大鼠每次80μg/kgMLA或生理盐水,连续单侧局部滴注1周。TAVNS组、α7nAChR(−/−)+TAVNS组、Hi MLA+TAVNS组、Hi生理盐水+TAVNS组于术前1h给予TAVNS,每日1次,连续21d。在实验指南实施前,对所有大鼠进行蔗糖偏好试验(SPT)、旷场试验(OFT)和强迫游泳试验(FST),以确保基线特征的一致性。详细的实验步骤如图1、图2所示。
CUMS模型已被证实为啮齿动物抑郁症最相关的模型之一。在这项研究中,根据前面描述的方法对CUMS模型进行了修改,并进行了一些适当的调整以增强不可预测性。大鼠接受7种不同的应激源:夹尾巴3min,冷水游泳(4°,5min),禁食24 h,关在湿笼子里(24 h,200ml水与100g木屑混合),断水(24 H),连续通宵光照(12 H)和电击脚(1 mA,每次10 s,间隔10 s,2℃)。其中一个应激源按照大鼠的随机顺序每天都会施行,每个应激源不会连续安排2天,以避免大鼠能预测到。
在造模第21天,用SPT、OFT和FST观察CUMS大鼠造模是否成功。在造模成功的基础上,分别给予α7nAChR(−/−)+TAVNS组、海马MLA+TAVNS组、海马生理盐水+TAVNS组,连续21d。刺激使用电针仪(HANS200A,南京济生医疗科技有限公司)。干预过程中,大鼠用2%异氟醚吸入剂(河北九森药业有限公司)持续,将两个相对的磁极(±)和自制的金属耳夹板(长2 cm,宽0.5 cm,厚0.05 cm)合并,连接到耳甲形成一个电子圈(见图3)。刺激参数如下:1刺激频率:2/15 Hz(2和15 Hz,每秒切换);2刺激强度:2 mA;3刺激持续时间:30min/d。
本研究中,分别在造模前、造模后和干预后称量大鼠重量。体重是判断大鼠模型是否成功以及干预是否有效的重要指标,可用于模拟抑郁症患者的躯体症状,如食欲变化。
造模第21天,Hiα7nAChR拮抗剂+TAVNS组和Hi生理盐水+TAVNS组进行脑室灌注。20只大鼠吸入2%(河北九山药业股份有限公司,河北,河北),于背侧海马区置管。在头皮上做了一个纵向切开,然后露出了头骨。门齿杆经过调整,使(冠状位bregma和lambda都在背侧中线上,利于定位,详见脑立体定位)bregma和lambda在同一高度。海马背侧坐标位于bregma坐标后3.6 mm,外侧2.75 mm,垂直3.0 mm(根据Paxinos和Watson图谱)。三颗螺丝钉固定在头盖骨的置管的周围;用螺丝缠绕在螺丝钉上,帮助固定由头骨塑料粘固剂形成的保护帽,该保护帽被用来包围和固定置管的套管。术后给予大鼠3天的休息。套管(RWD有限公司,中国深圳)固定在聚乙烯管上,并连接到微注射器(50μl,哈密尔顿)。α7nAChR拮抗剂甲基乌头碱(MLA,MedChemExpress Co.,Ltd.,中国)溶于无菌生理盐水(2 mg/ml,2.29 mM)中。参考并调整文献中的MLA剂量,输注程序设定为以1ul /min,并由微型注射器泵输送。MLA每次80μg/kg,连续单侧局部滴注1周。每次输液后,将注射器套管留在导管处10min。对照组注入等量无菌生理盐水。海马生理盐水组注入相同程序、相同体积的无菌生理盐水。
如前所述,分别在造模前、造模后和干预后进行行为学实验蔗糖偏好测试(SPT)。快感缺乏被认为是抑郁症的核心症状之一,本研究采用SPT对大鼠的快感缺失行为状况进行了评估。训练大鼠在适应周期中适应1%蔗糖溶液(AMRESC0335,美国)。所有大鼠在适应后禁食、断水23h,然后关在单独的笼子里,自由进入两个预称量的瓶子,瓶子里装有240ml蔗糖溶液(1%w/v)和240ml纯水1h,实验结束时,称1%蔗糖溶液和纯净水的瓶子并记录下来。蔗糖偏好百分比的差异由以下公式计算:蔗糖偏好比率(%)=蔗糖消耗量/(蔗糖消耗量+纯净水消耗量)×100%。
分别在造模前、造模后和干预后进行大鼠旷场运动试验(OFT),这是常用的测量啮齿动物一般活动和探索意愿的方法。使用的器材是一块100厘米×100厘米×40厘米的塑料板制成的正方形场地,四壁和底面均为黑色,底面用白色条纹分成20厘米×20厘米的等距方格。当大鼠被轻轻放置在广场中央时,允许它们自主运动和自由探索,同时我们监测并记录3min内的水平运动(至少三只爪子进入同一正方形,计1分)和垂直运动(大鼠后腿直立,计1分)的得分。每只大鼠测试后用75%乙醇清洗OFT装置,以避免这只大鼠留下的气味信号对下一只大鼠的干扰。整个实验过程由仪器上方约120厘米的摄像机记录下来。
在本研究中,分别在造模前、造模后和干预后对大鼠进行强迫游泳实验,这是评估啮齿动物行为绝望程度的常用方法。实验前,将大鼠分别放入强迫游泳水桶(白色塑料圆柱体,高60 cm,直径30 cm,水深45 cm)。实验前一天,大鼠在24~26℃的水中游泳15min,然后开始适应环境。实验当天,每只大鼠游泳5min,桶上方架设摄像。
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