肾结石中的钙结合蛋白对结石的形成有很大影响。这些蛋白质在肾结石中的空间分布对于评估蛋白质对结石形成的体内影响至关重要,尽管这些蛋白质的实际分布仍不清楚。我们揭示了三种不同蛋白质,即骨桥蛋白 (OPN)、肾凝血酶原片段 1 (RPTF-1) 和钙颗粒蛋白 A (Cal-A) 在保留原始矿物相和质地的人肾结石中的微观分布:一水草酸钙(COM) 和二水草酸钙 (COD)。OPN 和 RPTF-1 分布在 COM 和 COD 晶体内部,而 Cal-A 分布在晶体外部。OPN 和 RPTF-1 在具有镶嵌结构的 COM 晶体中显示出均匀分布,并且在 COD 晶体中与特定晶面平行的周期性分布。这些蛋白质的独特分布使我们能够根据它们的理化性质和每种蛋白质的复杂物理环境变化来解释每种蛋白质对 CaOx 晶体生长的不同体内影响。这种方法将进一步使我们能够阐明不同蛋白质对肾结石形成的体内影响。
肾结石疾病是一种常见疾病,一生中至少影响 1.7-14.8% 的人口。在多达 50% 的病例中,这种疾病会在第一次发作后的 5 年内复发。尽管这个健康问题很重要,但仍无法获得结石形成的预防性治疗。了解肾结石形成的发病机制对于减少肾结石疾病的发生和复发至关重要。大约 80% 的肾结石是草酸钙 (CaOx) 结石。CaOx结石由 ~ 90%的矿物相组成,即CaOx进一步分为一水草酸钙[Ca(C2O4)·H2O](COM)和二水草酸钙[Ca(C2O4)·2H2O](COD),以及有机物的一小部分,被认为是蛋白质基质。肾结石形成的发病机制包括涉及矿物质成分和蛋白质基质之间复杂相互作用的多步骤过程。已经在肾结石中鉴定了 100 多种蛋白质。其中,已知几种蛋白质,尤其是钙结合蛋白,在 CaOx 结石形成过程中起着至关重要的作用。这些蛋白质的具体作用已在结石形成的许多步骤中得到深入研究,包括晶体成核、晶体生长、晶体聚集和晶体粘附,并进行了大量体外结晶研究。体外研究有助于评估特定蛋白质对结石形成过程中特定步骤的影响。然而,在真正的结石形成环境中,大量蛋白质同时起作用,尿液中蛋白质、钙离子和草酸盐的浓度会发生波动。这种担忧促使我们研究真正的人类肾结石,以发现蛋白质对晶体生长的真正影响。在以前的大多数研究中,肾结石中的蛋白质的鉴定是在粉碎和提取后用质谱法进行的。因此,丢失了关于结石中蛋白质空间分布的信息。在非常有限的研究中,肾结石中的蛋白质鉴定是使用肾结石切片进行的,其中 CaOx 晶体通过脱钙完全去除 。这种方法可用于发现肾结石中蛋白质的分布,这可能有助于了解特定蛋白质对结石形成的影响。然而,在这种方法中丢失了大量记录在肾结石晶体中的关于结石形成的信息。70 多年以前的研究表明,通过使用光学显微镜对肾结石切片和抛光薄片进行晶相鉴定和晶体质地分类可以获得肾结石矿物信息的重要性。 缺乏对肾结石中原始 CaOx 晶体的蛋白质分布进行评估的分析一直是理解结石形成的一个相当大的障碍。蛋白质分布和晶相/形态的协调评估可以提供有关结石形成历史的重要信息。多重免疫荧光染色 (multi-IF 染色) 已被用于显示两种或多种蛋白质在生物样品的许多类型的软组织中的分布。将该技术应用于由多孔磷酸钙晶体组成的骨组织,也为 着眼于骨矿物质稳态的动态调节。然而,这并没有用于研究由致密和坚硬晶体组成的肾结石,尽管单次免疫荧光染色已被用于显示不保留矿物质信息的脱钙肾结石中特定蛋白质的分布。
本研究调查了能够对肾结石样本进行多 IF 染色并保留原始矿物质信息的条件。我们研究了三种不同的蛋白质,骨桥蛋白 (OPN)、肾凝血酶原片段 1 (RPTF-1) 和钙颗粒蛋白 A (Cal-A) 在 CaOx 结石的薄片中的分布。这些蛋白质在大多数 CaOx 结石中很常见,被称为钙结合蛋白,可能影响 CaOx 结石的形成。据我们所知,这是第一项在肾结石同观察多种基质蛋白的研究。我们根据每种蛋白质的分布、理化性质以及 CaOx 结石形成过程中每种蛋白质的复杂物理环境变化,进一步解释了每种蛋白质对 CaOx 晶体生长的不同体内影响。结果 基于显微观察结合 FT-IR 分析,肾结石样本的结构域分为三种类型,与 Schubert 和 Brien 报道的一致:由自形 COD 晶体组成的不规则纹理(类型 1,称为自形 COD COD 聚集体;图 1c),由不规则取向的 COM 晶体(类型 2,称为镶嵌 COM;图 1f)和同心层叠的 COM 晶体(类型 3,称为同心 COM;图 1i)组成的马赛克纹理.大多数观察到的 CaOx 石材样品由这三种纹理组成(表(表 11))。
图1本研究中分析的肾结石样本。(a) 样品 1。(b) 样品 1 薄片的偏光显微图像。(c) (b) 中白框区域的放大图像。(d) 样品 2。(e) 样品 2 薄片的偏光显微图像。(f) (e) 中白框区域的放大图像。(g) 样品 3。(h) 样品 3 薄片的偏光显微图像。(i) (h) 中白框区域的放大图像。表格1患者人口统计、结石的最大尺寸、矿物相的比例的总结。
CaOx草酸钙,Type1:自形COD,Type2:由不规则取向的COM组成的马赛克纹理,Type3:同心层叠的COM。将用于生物样品的多 IF 染色协议应用于通过典型地质方法制备的肾结石样品的薄片分析。对于应用,调整染色前薄片的蚀刻条件,发现只有在典型染色过程之前对抛光薄片进行轻微蚀刻(使用 pH 6.0 柠檬酸盐溶液 1 分钟)时,可视化才能成功.多 IF 染色使三种不同颜色的蛋白质(OPN:绿色、RPTF-1:蓝色和 Cal-A:红色)在三种不同的石材纹理同可视化。我们发现每种蛋白质根据其在 COM 和 COD 中的位置显示出特征分布模式。在 15 个样品中的 7 个样品中发现了自形 COD 聚集体(表(表 1)1)。自形COD聚集体主要存在于CaOx肾结石的外围(图(图1a-c)1a-c)。已知这些 COD 晶体具有由 {101} 面组成的四方双锥体形状。许多 COD 双锥体在两个锥体的尖端也具有 {110} 面(图 2b 和补充图 S1)。COD晶体的多IF染色图像如图2a所示,OPN周期性地出现在COD的{110}面上,如图2c中的白色箭头所示。该面与典型的 COD 体外晶体生长中没有出现的双锥体尖端的面相同。RPTF-1 沿{101} 面呈平行层,具有微米级间隔,如图 2d 中的箭头所示。该晶面是典型 COD 生长的特征。Cal-A 存在于 COD 晶体之外,在特定表面上没有优先吸附(图 2e)。在其他石头样品中也看到了相同的分布模式(补充图 S2)。
图2 自形 COD 聚集体中的蛋白质分布。(a) 多中频图像。白框区域的放大图像显示在(b)-(e)中。(b) 光学图像。水晶面用虚线和那些索引显示。(c) OPN 的 IF 图像。晶面和层状层分别用虚线和白色箭头表示。(d) RPTF-1 的 IF 图像。晶面和层状层分别用虚线和箭头表示。(e) Cal-A 的 IF 图像。晶面和层状层用虚线表示。马赛克 COM 纹理是 CaOx 结石中最普遍的纹理(图(图 1d-f)1d-f)。在 15 个样本中的 12 个样本中观察到了这种质地(表(表 1)1)。马赛克 COM 的多 IF 染色如图 3a、b.3a、b 所示。OPN 和 RPTF-1 存在于整个 COM 晶体中(图(图 3c,d)。3c,d)。相反,Cal-A 仅存在于晶界(即 COM 晶粒的表面)(图 3e)。我们进一步分析了蛋白质的线a 所示,以详细评估每种蛋白质分布模式(图 4a 上的黄线)。OPN 和 RPTF-1 在晶体区显示出较高的强度,而 Cal-A 在晶体区显示出较低的强度(图 4b)。Cal-A 的高强度仅沿晶界观察到。尽管 COM 颗粒的大小和形状不同(补充图 S3),但在许多样品中都可以看到这些蛋白质分布。
在单独的窗口中打开图 3镶嵌 COM 中的蛋白质分布。(a) 多中频图像。白框区域的放大图像显示在(b)-(e)中。(b) 光学图像。晶界用虚线表示。(c) OPN 的 IF 图像。晶界用虚线表示。(d) RPTF-1 的 IF 图像。晶界用虚线表示。(e) IF 图像。晶界用虚线表示。
图 4 COM 样品中蛋白质 IF 染色的线强度分布。(a) 马赛克 COM 纹理,带有箭头显示的线轮廓轨迹。(b) (a) 中马赛克 COM 颗粒上的线强度分布。(c) 锥形层压 COM 纹理,带有箭头显示的线轮廓轨迹。(d) (c) 中锥形层压 COM 颗粒上的线强度分布。同心 COM 也是 CaOx 结石的典型纹理(图(图 1g-i)。1g-i)。
我们在 15 个样本中的 10 个样本中发现了这种纹理(表(表 1)。1)。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 分布在同心层中(图 5a)。OPN 和 RPTF-1 作为恒定和规则层存在于整个 COM 晶体中,形成微米级间隔(图(图 5b,c)。5b,c)。相比之下,Cal-A 分布由位于石头外表面的不规则和相对较宽的层组成(图 5d)。SEM观察显示靠近每个Cal-A层的间隙层(图(图6a,b)6a,b)。形成间隙空间的两个表面都被微小的沉积物占据,这些沉积物与构成同心 COM 的主要 COM 晶体明显不同(图(图 6c,d)。6c,d)。同心 COM 中这些蛋白质的线强度分布在每个蛋白质分布中显示出尖峰(图(图 4c,d)。4c,d)。OPN 和 RPTF-1 的分布相似(即 5.58 ± 2.70 µm/层 OPN 和 5.99 ± 2.56 µm/层 RPTF-1)(补充表 S1)。然而,与 OPN 和 RPTF-1 相比,Cal-A 层具有明显大的间隔(即,23.17 ± 18.57 µm/层)。在其他 9 个样品中的大多数中都看到了类似的分布模式和间隔,尽管在少数样品中没有看到 Cal-A 层(补充图 S4 和表 S1)。
图 6 同心 COM 中的钙粒蛋白 A (Cal-A) 分布。(a) 薄片的扫描电子显微镜 (SEM) 图像。(b) 多 IF 染色和薄片 SEM 的合并图像。SEM 图像中显示的同心对齐间隙空间的位置与 Cal-A 层压的位置重叠。(c) 坠毁的同心 COM 的 SEM 图像。(d) (c) 中白框区域的放大图像。从中心到外部的同心 COM 宝石的方向用白色虚线箭头表示。COM 晶体之间的间隙空间用白色实线箭头表示。
在本研究中,CaOx结石中三种质地的比例以及三种质地中三种蛋白质的分布与结石形成者的年龄和性别没有明确的关系,尽管所调查的结石数量不足以进行相关性分析. OPN、RPTF-1 和 Cal-A 已知存在于 CaOx 结石中,这是基于通过电解从石粉提取物中检测出来的 9-11。OPN 在使用免疫细胞化学技术脱钙 CaOx 结石中的微观分布显示 OPN 分布在 CaOx 结石的同心薄片中 21, 30。本方法生动地可视化了先前认为的“有机层”中三种不同蛋白质的位置(图 7a,b)。我们在本研究中显示的同心 COM 中 OPN 的分布模式与之前的观察结果一致。我们进一步发现RPTF-1在同心COM中的分布模式与OPN几乎相同,而RPTF-1在COD晶体中的分布与OPN不同。相反,Cal-A 的分布模式与其他两种蛋白质完全不同。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的这些不同微尺度分布记录了 CaOx 结石形成的历史。
图 7CaOx 中三种主要质地的蛋白质分布示意图。( a )先前研究中考虑的蛋白质基质分布(白色:矿物相黑色:有机物)。(b) 本研究中发现的特定蛋白质分布(绿色:骨桥蛋白(OPN),蓝色:肾凝血酶原片段 1(RPTF-1),红色:钙颗粒蛋白 A(Cal-A)。1 型自体 COD,2 型镶嵌 CO。
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