线试剂盒荧光共聚焦检测线粒体膜电位的变化、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数和三磷酸腺苷(ATP)含量、免疫荧光联合共聚焦拍照观察Drp1向线粒体的迁移能力】需求与咨询,
芒柄花素是一种异黄酮化合物,由于其多种生物活性,包括对心血管系统的强大保护作用,已被广泛研究。然而,目前尚未研究芒柄花素对心脏纤维化的影响。本研究采用C57BL/6小鼠皮下注射异丙肾上腺素(ISO)建立心脏纤维化动物模型,并口服芒柄花素。结果表明,芒柄花素可逆转ISO诱发的早期心房波比值(E/A比值)所显示的心脏强直。Masson染色、免疫印迹、免疫组织化学和实时PCR显示,芒柄花素可显著抑制ISO诱导的心脏纤维化和纤维化相关蛋白(collage III、纤连蛋白、TGF-β1、α-SMA和波形蛋白)和基因(Col1a1、Col3a1、Acta2和Tgfb1)。此外,通过结合代谢组学和网络药理学,我们发现与线粒体功能相关的三个重要靶点(ALDH2、HADH和MAOB)参与了芒柄花素的有益作用。进一步的验证表明,这三个基因在心肌细胞中比在心脏成纤维细胞中具有更高的丰度。ISO处理后,心肌细胞中ALDH2和HADH的mRNA表达降低,而MOAB增加,并且这些现象被芒柄花素逆转。此外,我们还研究了心肌细胞中线粒体膜电位和ROS的产生,结果表明,芒柄花素有效改善了ISO诱导的线粒体功能障碍。总之,我们证明了芒柄花素通过调节心肌细胞中ALDH2、HADH和MAOB的表达来改善线粒体功能障碍并减轻β-肾上腺素能激活的心脏纤维化。
心室舒张功能下降是心脏纤维化的病理特征。E/A比率反映了左心室的舒张功能,这是通过脉搏波和组织多普勒成像确定的。皮下注射ISO 7天导致小鼠心肌收缩力增强(图S1),这是在C57BL/6小鼠中诱导心脏纤维化模型的常见方法。超声心动图可以通过测量E/A的比率来检测建模的成功。如图1B,C所示,ISO处理后小鼠的E/A比率显著增加。然而,模型给药低剂量芒柄花素(ISO+FL)和模型给药高剂量芒柄花素(ISO+FH)组的E/A比率低于ISO模型组(图1B,C),表明芒柄花素改善了ISO诱导的舒张功能障碍。此外,模型组的心脏重量/体重(HW/BW)和心脏重量/胫骨长度(HW/TL)增加,而芒柄花素逆转了这些现象(图1D,E)。此外,麦胚凝集素(WGA)的结果表明,芒柄花素可以抑制ISO诱导的小鼠心肌细胞肥大(图S2)。
图1 芒柄花素对心脏纤维化的影响。(A)动物实验的示意图;(B)左心室二尖瓣口充盈速度的代表性采集,显示早期(E)和晚期(A)波;(C)E/A值;(D)计算心脏重量与体重的比值;(E)计算心脏重量与胫骨长度的比值。所示数据为平均值±SEM;n=5,与对照组相比*p0.05,**p0.01,***p0.001;与模型相比,#p0.05,###p0.01,###p<0.001。
我们采用Masson染色法研究芒柄花素对心脏纤维化的影响。结果显示,在用芒柄花素处理后,ISO诱导的心脏纤维化显著逆转(图2A,B)。我们用蛋白质印迹法测定纤维化相关蛋白纤连蛋白、TGF-β1、α-SMA和波形蛋白。这些蛋白质的表达在ISO组中显著增加,表明这些小鼠中发生了纤维化。然而,用高剂量的芒柄花素预处理逆转了这一现象(图2C,D)。IHC染色的结果显示,在用芒柄花素处理后,胶原III的表达也受到抑制,在更高剂量下出现更大的抑制作用(图2E,F)。此外,我们使用实时PCR测量小鼠心脏中的纤维化相关基因(Col1a1、Col3a1、Acta2和Tgfb1)。在ISO处理后,Col1a1、Col3a1、Acta2和Tgfb1的表达显著增加,但芒柄花素降低了这些基因的表达(图2G-J)。总之,这些数据表明,芒柄花素改善了ISO诱导的心脏纤维化。
图2 芒柄花素改善ISO诱导的心脏纤维化。(A)Masson染色的代表性显微照片(bar=200µm);(B)纤维化面积的定量分析;(C)心脏纤连蛋白、TGF-β1、а-SMA和波形蛋白的蛋白质印迹分析;(D)纤连蛋白、TGF-β1、а-SMA和波形蛋白在心脏中表达的定量分析。(E)免疫组织化学的代表性图像(bar=50µm);(F)心脏纤维化面积的定量分析;(G)心脏纤维化基因的实时PCR分析。所示数据为平均值±SEM;n=5,与对照组相比,*p0.05,**p0.01***p0.001;与模型相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001。
我们使用LC-MS/MS检测血清中的代谢产物,以寻找芒柄花素改善心脏纤维化的潜在生物标志物。我们使用无监督主成分分析来比较不同组之间的代谢组学特征。如图S3所示,QC样品被聚集在一起并分为四组,表明实验条件处于稳定状态。PLS-DA方法是一种“监督”模型,可以最大限度地减少每组之间的差异,也用于分析数据。结果显示,四组之间有显著的分离,表明芒柄花素处理对代谢有明显影响(图3A)。OPLS-DA用于搜索两组之间的差异生物标志物(图3B-D)。我们从OPLS-DA中筛选出变量投影重要性(VIP)1的代谢产物。此外,OPLS-DA模型参数如表S4所示。根据VIP值(表S5),我们从对照组和ISO组中选择21个潜在生物标志物,从ISO组和ISO+FH组中选择24个潜在生物标记物(表S6)。有14种代谢物在两组生物标志物中重叠。热图分析用于可视化这14种生物标志物,从深红色到海军蓝的颜色变化表明代谢物的相对水平从高到低(图3E)。我们使用MetaboAnalyst 5.0对这14种生物标志物进行通路分析(图3F);收集与这些途径相关的基因,包括精氨酸生物合成、组氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、丁酸代谢、β-丙氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氮代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,以进行进一步分析。
图3 多变量分析的血清代谢谱。(A)PLS-DA数据中对照组、ISO组、ISO+FL组和ISO+FH组的得分散点图;(B)对照组和ISO组之间成对比较的OPLS-DA得分散点图;(C)ISO和ISO+FL组之间成对比较的OPLS-DA得分散点图;(D)ISO和ISO+FH组之间成对比较的OPLS-DA得分散点图;(E)14种代谢产物的聚类热图;(F)代谢途径涉及14种代谢产物。
为了阐明芒柄花素在减轻ISO诱导的心脏纤维化中的潜在机制,我们收集了芒柄花素和心脏纤维化的相关靶点,从BATMAM-TCM(中,Swiss ADME(,PharmMapper (数据库共获得284个与芒柄花素相关的靶点,通过GeneCards数据库获得3410个心脏纤维化相关靶点。我们将芒柄花素和心脏纤维化的靶点上传到Venny,发现有169个重叠靶点(表S7)(图4A),169个靶点的PPI网络如图4B所示。为了探索芒柄花素治疗心脏纤维化的新机制,我们还将来自KEGG的313个通路基因上传到Venny。从上述三个数据集的交叉点获得四个靶基因,即NOS2、ALDH2、HADH和MAOB(图4C),四个靶点的PPI网络如图4D所示。由于NOS2与其他三者没有直接联系,并且据报道,芒柄花素可调节NOS2,我们重点研究了芒柄花素对ALDH2、HADH和MAOB表达的影响。首先,我们检测ALDH2、HADH和MAOB在心肌细胞(CMs)和成纤维细胞(CFs)中的表达。结果显示,与CF相比,ALDH2、HADH和MAOB在CM中高度表达(图4E)。在CF中,HADH、MAOB和ALDH2的表达在用ISO处理后保持恒定(图S4A)。然而,在CM中,ISO处理后ALDH2和HADH的表达降低,而MAOB的表达增加。在用芒柄花素处理后,HADH、MAOB和ALDH2的表达趋于正常(图4F)。当用心肌细胞培养上清液处理CF时,MOAB的趋势与CM中的趋势相同(图S4B)。根据上述结果,我们用CM培养上清液孵育CFs。结果表明,在接受ISO处理CMs上清液的CFs中,胶原I、SMA和波形蛋白的蛋白表达升高。然而,用ISO加芒柄花素处理的CMs上清液未能诱导胶原I、SMA和波形蛋白的上调(图4G,H)。此外,我们在它们的mRNA水平上观察到了相同的趋势(图S5)。这些结果表明,芒柄花素直接作用于心肌细胞,心肌细胞调节成纤维细胞以改善心脏纤维化。
由于HADH、MAOB和ALDH2都与线粒体功能有关,因此我们研究了芒柄花素对心肌细胞线粒体功能的影响。我们用JC-1荧光染色法检测CMs线粒体膜电位的变化。在正常条件下,JC-1主要积聚在线粒体基质中,形成JC-1聚集体并产生红色荧光。ISO使膜电位超极化,导致JC-1聚集体的减少和红色荧光信号的减弱。同时,去极化增加了JC-1单体的数量,从而增加了绿色荧光,这在很大程度上被芒柄花素逆转(图5A)。此外,我们还考察了芒柄花素对ROS产生的影响。ISO处理后ROS的产生显著增加,而芒柄花素显著抑制ROS的生成(图5B)。这些结果进一步表。
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