该研究利用重组病毒载体(ORFV-PEDV-S)表达全长PEDV S蛋白,产生并筛选PEDV S特异性单克隆抗体(mAbs)(Hain et al., 2016)。大约获得25个分泌S特异性mAbs的原代杂交瘤细胞株,通过免疫荧光(IFA)和Western blot验证了它们的反应性。选择了11个mAbs进行了免疫荧光实验,评估了它们对PEDV原型株和S-INDEL株的反应性,并进行了荧光灭活试验(FFN),其中9个杂交瘤分泌物呈现出中和效价。这些杂交瘤细胞株经过限制稀释次级克隆,并进行了进一步的特性鉴定。研究还包括了一种不具有中和PEDV作用的单克隆抗体细胞株(SD33-1)和另一种之前在SD动物疾病研究与诊断实验室建立的细胞株(SD37-11)。通过进行腹水制剂生产,选择了每个原代杂交瘤细胞株的1-2个克隆。所有mAbs都能识别表达全长PEDV S的重组ORFV-PEDV-S感染的细胞,以及PEDV CO13株感染的细胞。此外,十一种中有十种mAbs能识别S-INDEL变异PEDV株,而mAb SD125-2不能。通过Western blot和ELISA鉴定了PEDV-S mAbs的反应性,其中大多数mAbs特异性识别S1-S2连接区域的线性表位。在ELISA测试中,所有mAbs对PEDV CO13株均有反应,十种中有十种(除SD125-2外)对S-INDEL株Iowa106有反应。此外,对S蛋白的缩短版本进行了反应性评估,结果显示大多数mAbs特异性识别S1-S2连接区域的表位。值得注意的是,mAb SD125-2对PEDV CO13株有反应,但不识别S1和S1-S2缩短蛋白,表明其可能识别S蛋白的其他区域。此外,mAb SD131-3在Western blot上与S1-S2蛋白反应,在ELISA上与S1和S1-S2缩短蛋白反应,可能是混合的杂交瘤群体。
该研究通过荧光灭活(FFN)和斑消减中和(PRN)试验评估了S特异性mAbs的中和活性。为此,所有mAbs均从腹水中纯化,并稀释至工作浓度1.5 mg/mL(PBS中)。通过两倍稀释的系列浓度(1:20至1:2560)进行三次重复测试,以进行FFN或PRN试验。终点滴度被认为是能够在体外将PEDV感染性降低90%(FFN)或80%(PRN)的最高mAb稀释的倒数。十一种中有十种mAbs对PEDV CO13株呈现出中和滴度,范围从1:40到1:640,对PEDV S-INDEL变异株的中和滴度范围从1:40到1:160。同样,对PEDV CO13株的PRN滴度范围在1:40到1:640之间。与我们初步筛选结果一致,PEDV S特异性mAb SD33-1没有观察到中和活性。这些结果表明,在体外,十种S特异性mAbs对PEDV表现出强有力的中和活性。
为了确定PEDV S蛋白中的中和域,这里开发的中和mAbs的表位特异性通过肽段ELISA进行了评估。已经显示PEDV S蛋白的四个区域是中和抗体的靶标,包括NTD/S0区域、RBD(氨基酸[aa] 499–600)、S1-S2连接区(aa 639–789)和S蛋白的羧基末端区域。一些这些区域内的线性表位已经显示能诱导对PEDV的中和抗体,包括aa位置在747–774和1371–1377的表位。由于这里开发的大多数mAbs在Western blot和/或ELISA中识别S1-S2(aa 630–800)重组蛋白,因此首先对其进行了针对位于S2氨基末端的747–774表位的筛选。接下来,对mAbs进行了针对位于S的羧基末端的1371–1377的表位的筛选。值得注意的是,六种mAbs识别了位于747–774的表位,而mAb SD125-2特异性地反应了1371–1377的表位。为了确认mAbs的特异性并进一步分析S1-S2连接区域内的中和表位,所有mAbs都进行了对两个较小表位的筛选,这两个表位几乎完全位于747–774表位内。结果显示八种mAbs识别了位于744–759的表位,而只有两种mAbs识别了位于756–771的表位。这些结果表明,S2亚单位蛋白的氨基末端包含高度抗原性、可能是免疫优势的PEDV中和表位,并进一步表明744–759表位可能代表S1-S2连接区域的核心中和表位。
研究表明,S蛋白的S1-S2连接区域包含主要的中和表位。值得注意的是,这里开发的大多数中和mAbs特异性识别了跨越S1-S2连接区域的S蛋白的缩短形式(aa 630–800)。为了评估mAbs的中和活性是否与它们识别S的这一区域的能力相对应,确定了终点FFN和ELISA滴度之间的相关性。如图7A所示,所有mAbs的终点中和和S1-S2 ELISA滴度相似,导致FFN和ELISA测试结果之间呈强烈的正相关(R2 = 0.704;图7B)。值得注意的是,恢复期多克隆猪血清中检测到的中和滴度也与通过S1-S2间接ELISA检测到的抗体滴度呈高度相关。
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