儿童高级别胶质瘤(PHGG)是一种侵袭性脑肿瘤,5年生存率从低于2%到20%不等。具有广泛的肿瘤间和瘤内异质性。在描述和理解基本的肿瘤生物学,以及治疗肿瘤方面带来了挑战。PHGG具有高度侵袭性,并在正常细胞中弥漫性生长,限制了手术作为一种治疗选择。放射治疗暂时有效,但肿瘤几乎总是复发。尽管有数百个细胞毒性和靶向化疗的临床试验,放疗仍然是唯一被接受的标准治疗。
PHGG细胞的具体类型和来源尚未完全确定。最近的研究表明,少突胶质细胞祖细胞是一个PHGG细胞的来源。PHGG和HGG来自于不同的胚层。HGGs通常包括EGFR扩增、TERT启动子突变、IDH改变和7号染色体增加/10号染色体丢失,而这在PHGG中很少发生。这些差异需要对PHGG生物学进行单独的研究。
因此,研究者鉴定了类似于PHGG细胞的正常中枢神经系统细胞类型,PHGG中存在的中枢神经系统驻留细胞和系统免疫细胞,以及肿瘤和免疫细胞之间的潜在相互作用。研究者假设PHGG由几种不同的胶质细胞类型组成,不同病例的比例不同,肿瘤细胞表型可能通过系统或CNS驻留(小胶质细胞)免疫细胞的活动而改变。
研究者对19个患者来源的PHGG样本进行了单细胞RNA-Seq(scRNA-Seq)、整体甲基化和RNA-Seq。细胞捕获包括免疫细胞,迄今为止,这在PHGG的单细胞研究中很少受到关注。分别分析了来自肿瘤和免疫细胞的单细胞转录组数据。通过差异基因表达和通路分析,阐明了与肿瘤生长相关的特殊群体。进行了多重免疫荧光(IF)染色,以验证蛋白水平上的转录组分析的结果,并研究肿瘤和免疫细胞之间的空间关系。
患者和疾病特征研究者将样本分为6个亚组:H3K27M弥漫中线样本),PHGG上皮样/巨细胞特征(e-GBM 4样本),放射诱导高级别胶质瘤(RIG 5样本),IDH野生型半球胶质母细胞瘤(GBM 3样本),弥漫性半球胶质瘤H3G34突变(G34-GBM 1样本)和PHGG其他未说明(1样本)。
对完整的scRNA-Seq数据集的无监督聚类将肿瘤与免疫细胞区分开来,并识别出每种免疫细胞的多个亚型(图1a-b)。部分由于肿瘤样本之间的多样性,发现肿瘤细胞的无监督聚类产生了同一细胞类型的多个患者特异性亚簇。研究者决定按细胞类型映射到一个有监督聚类的正常脑图谱,然后执行无监督聚类来分析每种细胞类型(图1c)。研究者同样地绘制了肿瘤免疫细胞群到正常PBMC的图谱。进行分析的群体包括7348个肿瘤细胞和6292个免疫细胞(图1d)。
图1 CNV分析和生物信息学聚类鉴定了肿瘤细胞的正常中枢神经系统类似物。a. 和 b.肿瘤细胞的UMAP投影显示,Seurat无监督簇成员(a)与细胞类型(b)相一致,但由于表型差异,如细胞周期、血管生成、转移或炎症基因的表达,Seurat簇包括额外的亚组;c.对scRNA-Seq数据的分析策略;d.从监督聚类中预测的非免疫细胞类型;e.通过样本预测的肿瘤细胞类型百分比(由于消除低表达细胞后的细胞计数为10,一个样本从此显示中被省略)。
肿瘤细胞被映射到5种主要的预测细胞类型:少突胶质细胞祖细胞(OPCs)、间充质样细胞(Mes)、星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞(图1d)。个体样本的原代细胞类型的比例有所不同(图1e)。PHGG亚型分析显示,RIGs在Mes细胞中富集,上皮样肿瘤在OPCs中耗尽。
图2不同预测的肿瘤细胞类型间的基因表达差异。a.通过基因表达得到的热图显示了三种主要的肿瘤细胞类型的分离;b.主要细胞类型的非负性基质分解(NMF)显示OPC细胞和Mes细胞与星形胶质细胞相似,但有显著差异;c.标记基因的表达证实了细胞类型的差异,表达了已知的特征标记;d.OPCs富集于控制干细胞性特征的ASCL1、SOX2和SOX10中,以及干细胞标记物NES;e.OPCs富含转录因子,这些转录因子的表达先于间充质表型的出现,而Mes细胞富集于间充质细胞的特征基因,这表明Mes细胞可能在肿瘤生长过程中由OPCs发展而来;f.预测细胞类型中的OPC和Mes标记基因;g.Ki-67染色显示OPCs和星形胶质细胞的增殖能力高于所有细胞;Mes细胞具有增殖亚群,但平均增殖能力低于平均细胞群。
差异基因表达:分析了无监督簇的差异基因表达和预测的肿瘤细胞类型,以更好地了解其特征和潜在的起源。还进行了基因集合富集分析(GSEA)和单样本基因集富集分析(ssGSEA),以确定富集和耗尽的表达途径。细胞类型根据基因表达形成不同的实体(图2a-b)。OPCs和Mes簇与星形胶质细胞群的关系比两者都更密切(图2b)。
OPCs高表达了少突胶质细胞谱系转录因子OLIG1和OLIG2(图2c)。OPCs的转录因子ASCL1、SOX2和SOX10在干细胞维持和中枢神经系统发育中非常重要,以及干细胞标记物NES(图2d)。Mes细胞也富含PDGFRA、IGFBP2和IGFBP5,它们与HGG的间充质表型以及迁移和侵袭增加有关(图2c)。Mes细胞类型中大多数差异最高的基因,包括GNAS、IGFBP2、IGFBP5、PTN、S100B、CD63和VIM在转移过程中发挥作用 (图2c)。
在OPCs中高表达的OLIG1、OLIG2和PTPRZ1等基因也在Mes群体中表达,而高表达的Mes基因如IGFBP2、GNAS和PDGFRA也在OPCs中表达。OPCs还表达了PTN和S100B,它们参与了诱导间充质表型的出现(图2c)。研究者绘制了抑制间充质基因表达的转录因子、重塑细胞转化的钙粘蛋白以及间充质细胞中表达的基因的表达图(图2e)。研究者绘制了参与间充质细胞分化的OPC标记物和基因的表达,这也将OPCs与Mes细胞区分开来(图2f)。这些结果表明,Mes细胞可能来源于OPCs。
预测的星形胶质细胞群体在特征性星形胶质细胞基因GFAP和APOE以及金属硫蛋白家族基因(图2c)。金属硫蛋白促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进血管生成。金属硫蛋白的高表达与HGG的低生存率相关。与HGG相比,星形胶质细胞在EGFR中仅略有富集。预测的星形胶质细胞的基因表达证实了它们作为星形胶质细胞的群体。
为了确定星形胶质细胞、OPC和Mes群体是否有助于肿瘤的进展,研究者评估了它们是否富集了增殖标志物MKI67的表达。而所有这三种细胞类型都包括了一部分表达MKI67的细胞,目前尚不清楚它们是否都有助于肿瘤的进展。因此,研究者分别对Ki67与星形胶质细胞、OPC和Mes细胞标志物GFAP、Olig2和IGFBP2进行了免疫荧光(IF)共染色。这些结果证实了所有三种细胞类型都具有增殖性,并有助于肿瘤的进展(图2g)。
差异基因表达分析建立了星形胶质细胞、OPC和Mes群体的独立身份,它们在PHGG患者样本中包括三种主要的肿瘤细胞类型。Ki67染色证实所有三种细胞类型都有助于肿瘤的进展。基因表达模式证实了OPCs与Mes细胞密切相关,并提出了Mes细胞来源于OPCs的可能性。
图3肿瘤细胞类型的途径富集情况不同。a.基于大量RNA-Seq数据(所有基因集的FDR1.6E-4),来自HGG的基因集的富集显示出肿瘤间的异质性;b.肿瘤细胞类型和小胶质细胞在HGG基因集的富集程度上有所不同;c.肿瘤细胞类型的通路分析;d.组蛋白甲基化标记基因集预测干细胞性/分化;e.热图显示了主要肿瘤细胞类型之间的致癌过程和靶向信号通路的差异。
通路分析:为了进一步探索预测的肿瘤细胞类型之间的区别,研究者采用GSEA的方法来识别富集的信号通路和功能通路。使用大量RNA-Seq数据的GSEA显示,样本中间充质、经典和神经前HGG亚型的基因总体富集存在差异,证实了样本群体中的异质性(图3a)。
scRNA-Seq数据的GSEA显示,肿瘤细胞类型在HGG基因集中的表达不同:OPCs主要是神经前表达,Mes细胞表现出经典表达和神经前表达的混合表达,星形胶质细胞主要是经典表达(图3b)。这三种肿瘤细胞类型中没有一种富集于HGG间充质基因集的表达,但研究者发现了这种富集的免疫细胞群(图3b)。这些免疫细胞富集于小胶质细胞标记物AIF1中,因此研究者初步将它们确定为CNSs常驻免疫细胞的身份。
与OPC细胞和Mes细胞类型相比,星形胶质细胞的通路表达存在多种差异(图3b-d)。OPCs和Mes细胞在自我更新、细胞周期、蛋白质翻译和DNA修复基因集方面富集(图3c)。它们具有代谢活性,并在MYC转录因子靶点的表达中富集,如前所述,与神经前HGG相关的基因(图3b-c)。OPCs和Mes细胞也富集于核心胚胎干细胞的基因表达。(图3d)。相比之下,星形胶质细胞富含与谱系定向相关的表观遗传组蛋白标记(图3d)。星形胶质细胞亚群在基底径向胶质细胞中表达的基因——正常发育过程中神经元和胶质谱系细胞的前体,这表明其中一部分是高度不成熟的(图3c)。OPCs被耗尽,星形胶质细胞通过炎症和免疫反应通路的表达而富集(图3e)。与OPCs相比,Mes细胞在炎症和免疫反应途径中富集,但不如星形胶质细胞富集(图3e)。
研究者按细胞类型对代表常见癌症信号通路的基因集的表达水平进行了分类(图3e)。值得注意的是,星形胶质细胞和Mes细胞在炎症通路的表达中富集,星形胶质细胞在DNA修复基因表达中减少,在干细胞基因富集中存在变异性。这些细胞类型在癌症通路基因的表达上有很大差异,但所有的细胞类型都在研究者评估的至少一种癌症信号通路中富集(图3e)。
总之,星形胶质细胞、OPC和Mes细胞群具有基因表达程序,证实了它们作为肿瘤细胞的身份。观察到的基因表达的可变性表明,三种肿瘤细胞类型的致癌驱动因素不同(图3e)。所有三个群体都包括未分化的细胞。
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