杜仲叶(EL)作为一种中草药,具有降脂的生物潜力。经过发酵,EL被制成具有降脂和抗氧化活性的各种产品。然而,发酵杜仲叶(FEL)的抗高脂血症机制目前尚不清楚。我们旨在评价FEL对高脂血症的影响,并从调节肠道稳态和宿主代谢的角度探讨其作用机制;采用高脂饮食喂养Wistar大鼠8周,建立高脂血症动物模型;FEL水提取物(FELE)的给药剂量分别为128、256和512 mg/kg/d;我们进行了血清生化参数检测、组织病理切片分析、肠道微生物群16S rDNA测序和非靶向粪便代谢组学分析,以确定FELE对高脂血症的治疗效果并预测相关途径;采用免疫荧光(IF)和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测与脂质相关的蛋白质和基因的变化;采用UPLC-MS对FELE中的56种成分进行了鉴定,其中有机酸、黄酮类化合物和酚酸类成分占大多数。结果显示,FELE的干预显著降低了高脂血症大鼠的体重、脂质积累以及总胆固醇(TC)、三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平,同时升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。同时,FELE改善了炎症因子和氧化应激因子,即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)。这些结果表明,FETE可以有效降低血脂,减轻高脂血症引起的炎症和氧化损伤。从机制上讲,FELE通过降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例和增加益生菌的丰度来恢复肠道微生物群的稳态,特别是乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014-Unclassified,同时通过氨基酸、胆汁酸和脂质相关代谢途径调节代谢。此外,Pearson相关性分析发现,上调的胆红素、苏氨酸、多巴胺和下调的lipocholic acid、d-鞘氨醇是FELE干预后的关键代谢产物。IF和qRT-PCR分析显示,FELE上调脂肪酸氧化蛋白和基因(PPARα,CPT1A)、胆汁酸合成和排泄蛋白和基因的表达(LXRα,CYP7A1,FXR),并通过调节肠道微生物群下调脂肪生成基因(SREBP-1c)的表达,以改善代谢并发挥降脂作用。这项工作填补了FEL降脂机制的空白。FELE可以通过调节肠道微生物群的稳态和代谢来改善HFD诱导的高脂血症。因此,FEL具有发展成为新型降脂药物的潜力。
我们在FELE鉴定出56种单体,如图2和表1所示。其中有机酸17种,黄酮类14种,酚类和酚酸类11种,环烯醚萜类3种,生物碱3种。绿原酸、咖啡酸、peltatoside、芦丁、槲皮素3-葡萄糖苷、槲皮素、13(S)-HOTrE、9(S)HOTrE和9-HODE在FELE中含量较高。与EL的先前报告相比,发酵后化学成分的相对含量发生了显著变化,而成分的类别没有显著差异。
图2 高效液相色谱-质谱联用技术对FELE中的组分进行定性分析。(A)FELE的总离子流图;(B)FELE中主要成分的结构式。
如图3A、B、C所示,实验结束时,高脂饮食(HFD)组大鼠的体重、肝脏和脂肪指数显著高于正常饮食(ND)组(p0.01),FELE组和血脂康胶囊(XZK)组的体重明显低于HFD组(p0.01),FELE-H组和XZK组的肝脏指数和脂肪指数明显低于HFD组(p0.05)。HFD组大鼠的脂肪大约是ND组的1.83倍。低、中、高FELE组的脂肪含量分别是ND组的1.46倍、1.29倍和1.13倍。因此,长期使用FELE可以减少高脂血症大鼠的脂肪积累。
血清脂质水平显示FELE可显著改善HFD引起的高脂血症。如图3 D-M所示,与HFD组相比,高剂量FELE可显著降低血清TC(p0.01)、TG(p0.05)、LDL-C(p0.01)水平,并显著升高HDL-C(p0.01)。长期喂食HFD会导致大鼠体内炎症因子失衡,导致代谢紊乱。HFD组血清TNF-α、IL-6和MCP-1水平明显高于ND组(p0.01)。ZXK组和FELE组均抵消了HFD引起的炎症因子水平的升高(p0.01)。MDA含量是肝脏脂质过氧化的指标,而SOD和CAT则表明肝脏的抗氧化能力。结果表明:FELE-M和FELE-H喂养大鼠后MDA含量显著下降(p0.01),而SOD(p0.01)和CAT(p0.01)水平显著升高,可减轻肝脏脂质氧化反应。
我们用H&E染色切片观察肝脏和脂肪组织的结构损伤。如图4A所示,与ND组相比,HFD组的中心静脉出现空泡变性,肝细胞充满脂肪滴。这些组织学变化在给予FELE和XZK后恢复。肾周脂肪的H&E染色切片如图4B所示。ND组脂肪细胞排列规则紧密,细胞大小均匀,而HFD组脂肪细胞明显膨胀,严重变性,排列不规则。FELE和XZK给药后,脂肪细胞体积减少,同一视野内的脂肪细胞数量增加,细胞排列相对紧凑和规则。FELE-H组的脂肪细胞体积接近ND组。油红O染色后(图4C),HFD组大鼠肝细胞充满红色染色,而给予FELE和XZK后,红色染色的比例下降。
图4 FELE摄入对肝脏和脂肪组织的影响。(A)肝细胞的H&E染色切片。HFD组大鼠肝细胞损伤严重。黑色箭头表示肝细胞中充满了脂肪滴,而红色箭头则表示肝细胞大量空泡变性。(B)脂肪组织。箭头表示明显肿胀,HFD组中脂肪组织的不规则排列、严重变性。(C)肝细胞的ORO染色切片(放大倍数,200,比例尺:50μm)。
我们采用16s rDNA对ND、HFD和高剂量FELE组的肠道微生物群进行测序,在选择有效读取之后,总共生成了1292188个有效读取。扩增子序列变异(ASV)经过数据过滤和去复制后进行计数,可以提高数据的准确性和物种的分辨率。维恩图(图5A)直观地说明了各组共同和独特的ASV丰度。Alpha多样性指数(表S3)用于评估肠道微生物群的多样性和丰富度。HFD组的Chao1、Shannon、Simpson和Pielou均匀度与ND组相比明显下降(p0.05),而FELE组的这些指标增加,其中Chao1和Shannon的变化具有统计学意义(p0.05)。在基于UniFrac的PCoA中,ND、HFD和FELE组之间存在明显的分离(图5B),这表明每组的肠道微生物群组成是单独聚集的,FELE可以改变HFD大鼠的肠道微生物组组成。结果表明,FELE能提高群落丰度、群落多样性和群落均匀性。
图5 FELE对高脂血症大鼠粪便微生物群的影响。(A)维恩图显示了ASV的重叠,(B)基于UniFrac的PCoA,(C)门水平的相对丰度,(D)厚壁菌门与拟杆菌门的比例,(E)属水平的相对丰度,(F)对HFD有反应的变化属与高脂血症相关指数的相关性。*r0.5,p<0.05;**r0.5和p0.01。(G),(H)通过线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)鉴定ND、HFD和FELE中的大多数特征分类群。数据表示为平均值±标准差(n=6)。与ND组比较,**p<0.01。与HFD组相比,#p<0.05。
通过物种分析,各组之间的优势肠道微生物群物种水平不同。在门水平上,主要鉴定出厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和疣微菌门,其中厚壁菌和拟杆菌门是相对丰度最高的优势细菌(图5C)。如图5D所示,HFD组的F/B比率明显高于ND组(p0.01),这与相关论文的结果一致。FELE组的F/B比值显著降低(p0.05),变形菌丰度降低,但无显著差异。在属水平上,我们对丰度最高的15种细菌进行了分析(图5E)。HFD组的Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014_unclassified的丰度显著低于ND组(p0.05)。FELE组乳杆菌、Rombousia、罗氏菌的丰度明显高于HFD组(p0.05)。此外,HFD组瘤胃球菌、Clostridiales_unclassified和阿克曼菌的丰度高于ND组,FELE干预后下降。这些结果表明,FELE可以显著影响HFD大鼠肠道微生物群的组成。
我们计算了丰度变化显著的前15个属与高脂血症相关指数的相关性。结果显示为热图(图5F)。有6种细菌与三种以上的高脂血症相关指标相关,这些指标以红框表示。结合属的丰富性,瘤胃球菌、乳杆菌、Rombousia、拟杆菌、罗氏菌、Clostridia_UCG-014_Unclassified可能是FELE改善大鼠高脂血症的靶点。
我们通过LEfSe分析,对微生物群落进行分析,以确定与不同饮食干预相关的最显著的不同肠道微生物类群。如图5G和H所示,我们在3个类群中发现了10个丰富的差异分类群,包括4个属。在属水平上,FELE类群包含Bacilli和梭状芽孢杆菌属的优势属。但是,相。
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