虽然很多细胞生物实验室都擅长免疫荧光实验,但我却是我们实验室做这个的独苗,踩坑无数!一开始的时候,做,很难保证细胞生长在同一层面,最后不是染色不均匀就是脱片了;载玻片也不知道要用明胶包被,清洗的时候组织直接整片 say goodbye,气得导师直接派我去他好兄弟实验室取取经。结果发现人家用的都是
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4. 在 ibidi 腔室载玻片中,带有可移除腔室的硅胶垫圈安装在标准载玻片上,适合长期储存装有盖玻片的样品。
现在以粘附的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在 µ-Slide 8 Well high 中培养和免疫荧光染色为例向大家介绍。
Tips:在开始免疫细胞化学实验之前,需要检查几个重要参数,例如目标蛋白质的表达水平、最佳细胞密度、合适的细胞培养容器形状和底物/涂层以及确认最佳抗体稀释度。此外,IF 染色必须要有阳性和阴性对照,建议在实验前进行文献查阅调研。
• 细胞培养基:内皮细胞基础培养基(C-22210,Promocell)和内皮细胞生长培养基补充混合物(C-39215,Promocell)
使用前请阅读说明 µ-Slide 8 Well high,ibiTreat,所有步骤均在无菌条件下操作。在开始实验之前,在标准细胞培养瓶中处理 HUVEC(例如,T75 培养瓶,在 0.05 M HCl 中涂有 6.7 µg/mL 胶原蛋白 IV 处理 1 小时),细胞粘附在底部。
Tips:细胞在实验当天应状态正常且汇合度合适。整个实验应尽量快的完成防止孔变干。如果没有另外说明,所有给定的体积都是按照每一孔,所有的孵育步骤都在室温下进行。
• 计数细胞,在内皮细胞基础培养基和内皮细胞生长培养基补充混合物中,并调整到最终浓度为 2 x 105 cells/mL 。
• 加入 150 µL 一抗,孵育 2 小时(请注意,有些抗体需要在 4°C 下过夜孵育)。
对 HUVEC 在 µ-Slide 8 Well high 中免疫染色的宽视场荧光显微镜观察。F-肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽(红色)染色。α-微管蛋白抗体用于染色微管(绿色)。用 DAPI(蓝色)染细胞核。该图为尼康显微镜 60 倍油浸物镜拍摄。
免疫荧光染色是一种灵敏性很高的方法,需要大量的经验积攒和步骤优化。如果IF 染色未达到预期效果,可按照以下表格进行可能原因的排查。
学到这里是否对自己还没开始的免疫荧光信心满满?正在被不合格免疫荧光结果折磨的同学是否已经跃跃欲试?
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