由于类器官的构建,常常伴随着免疫荧光分析来研究类器官中细胞标志物的表达,今天为大家「偷」来了师兄的实验操作大礼包,
为了优化培养容器的空间并简化类器官的培养操作,我们建议在 6 孔板中以 Cultrex® BME 圆顶(dome)包埋的形式培养类器官。如有需要,可扩展至更大面积的培养板。
每个圆顶中含有 50 μL 重悬于 BME 中的类器官。如图 1 所示,在 6 孔板的每孔中放置 6 个圆顶状液滴。操作完成后,将培养板置于组织培养箱中,在 37℃ 下聚合 BME。在 BME 聚合后,向每孔中加入 3 mL 类器官培养基。
图 1 在 6 孔板的每孔中放置类器官 -Cultrex BME 混合物,形成圆顶结构。1)将 Cultrex BME 和类器官置于冰上,另外同时将培养容器预热至 37℃,以便快速诱导 BME 的聚合,这可以防止类器官附着在孔的底部。2)在收集后,将类器官沉淀重悬在 Cultrex BME 中,并通过移液在每孔中(圆圈)分别滴加 50 μL 的类器官-BME 圆顶状液滴。3)6 孔板的每孔中可放置 6~8 个圆顶状液滴;4)6 孔板的每孔中形成圆顶结构。
2. 弃去培养基或分化培养基,用 5 mL 冷的(2~8℃)PBS 洗涤各孔,然后与 5 mL 冷的(2~8℃)Cultrex® 类器官收获液共同孵育 30~60 分钟。
3. 在基质胶消融并释放类器官之后,将溶液转移至锥形离心管内,通过连接在注射器上的 20 号针头对类器官进行机械处理。
6. 最后一次离心后,弃去 PBS,将类器官重悬在 Cultrex® BME 中,重新铺板。
注:PFA 有时会导致 Cultrex BME 的解聚。戊二醛的添加解决了这个问题,不过,戊二醛的自发荧光可能较高,因此每个方案中的淬灭步骤都必须优化。
4. 用勺子或刮刀小心地刮下类器官-BME 圆顶结构,将其置于含有 20% 蔗糖溶液(由 1XPBS 制备)的 50 mL 锥形管中,并在 2~8℃ 下放置过夜,或直至圆顶结构沉入管底(最多需要 3 天)。
5. 从蔗糖溶液中取出圆顶结构,将其置于含有最佳切削温度(OCT)化合物的包埋模具中。尽可能去除蔗糖溶液。每个包埋模具中放置几个圆顶结构。我们建议每块至少包埋 6 个类器官-BME 圆顶结构。
6. 快速冷冻,并保存在 -70℃ 以下。使用冷冻切片机,将类器官进行冷冻切片。关于类器官冷冻切片的厚度,我们建议为 10 μm。
图 2 对 BME 圆顶结构中的类器官进行固定和包埋。用 PFA和 GA 溶液固定类器官圆顶结构,并浸没在 20% 蔗糖溶液中进行冷冻保护,然后用 OCT 包埋。在含有 OCT 的冷冻模具中放置几个圆顶结构后,对类器官进行快速冷冻,并保存在 -70℃ 以下,直到进行冷冻切片。
2. 在室温下将玻片放入 10mM NaBH4 溶液(由1XPBS 制备)中孵育两次,每次 5 分钟,淬灭固定步骤后产生的醛基。如果检测到自发荧光,可延长淬灭时间。
注:淬灭样品时也可以使用 0.2 M 甘氨酸溶液(由 1XPBS 制备)来孵育两次,每次孵育 15 分钟。
7. 用封闭液将一抗稀释至所需的终浓度。轻弹玻片一侧,去除封闭液,无需清洗。在类器官上加入 200~400 μL 一抗。让一抗扩散至整张玻片。
14. 如需复染,可用 DAPI(Tocris,货号5748)或 Hoechst 33342(Tocris,货号5117)的稀释液对细胞核进行染色,也可用鬼笔环肽(Phalloidin)对肌动蛋白进行染色。三种复染化合物均用 1XPBS 稀释。
小鼠小肠和结肠类器官都形成了一个中空的内腔,在固定和冷冻切片步骤后保留这些结构的完整性可能颇具挑战。如图 3 和图 4 所示,按照上面的方案操作后,类器官的结构得以保留。
图 3 小鼠小肠类器官的分化。A)小鼠小肠类器官通常生长为球状的中空结构。B)一旦分化,隐窝和绒毛结构开始形成。E-Cadherin 的免疫荧光分析(绿色)显示了紧密连接处的染色。细胞核用 DAPI 进行染色(蓝色)。比例尺:50 μm。
图 4 小鼠结肠类器官。小鼠结肠类器官经过 5 天的培养并用 E-Cadherin 荧光抗体进行免疫染色(红色)后的代表性图像。比例尺:50 μm。细胞核用 DAPI 进行染色(蓝色)。
采用这种方案还可以分析各种标志物。图 5 中的 Ki-67 阳性细胞显示了小鼠小肠类器官的隐窝样结构内的增殖细胞。图 6 则显示了小鼠结肠类器官如何产生和分泌 Mucin 2(MUC2),这是一种由肠上皮的杯状细胞分泌产生的粘液形成糖蛋白。
图 5 对小鼠小肠类器官的隐窝样芽结构中的增殖细胞进行观察。Ki-67 显示了类似于小肠隐窝的出芽结构(白色虚线)中的增殖细胞(绿色,箭头)。DAPI 作为细胞核复染剂(蓝色)。比例尺:100 μm。
图 6 小鼠结肠类器官中肠道分化标志物的表达。A)小鼠结肠类器官表达肠道分化标志物 Mucin 2,这是杯状细胞的标志物(红色)。B)图像与A相同,但只显示了红色通道。C)箭头显示了表达 Mucin 2 的杯状细胞。DAPI 作为细胞核复染剂(蓝色)。
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