科研丨Nature子刊(IF:17.69): 不平衡的肠道菌群通过塑造肝脏炎症微环境促进肝细胞癌的发展
肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因,而晚期HCC的治疗选择有限。本研究观察到肠道生态失调会影响抗肿瘤免疫监测并推动肝病向癌症发展。Nlrp6-/-小鼠中失调的微生物群诱导肝单核型髓系抑制性细胞(mMDSC)扩增,并抑制T细胞增殖。这种表型可通过粪便菌群移植传播,经抗生素治疗后可逆转,表明肿瘤微环境具有高度可塑性。Akkermansia muciniphila的缺失与mMDSC丰度相关,重新引入此菌可恢复肠道屏障功能并降低肝脏炎症和纤维化。肝硬化患者肝组织中细菌丰度增加,可引起明显的转录变化,包括激活纤维-炎症通路以及介导癌症免疫抑制的回路。本研究表明,肠道菌群可重塑肝脏炎症微环境,为癌症预防和治疗开辟了新途径。
NLRP6炎性小体是肠道中维持宿主-微生物稳态的重要调节因子,为了研究Nlrp6-/-介导的肠道生态失调对脂肪性肝炎进展的影响,我们将NEMOΔhepa与Nlrp6-/-小鼠交配得到NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠。与NEMOΔhepa小鼠相比,52周龄的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出更高的肿瘤负荷,而且肝脏/体重比也明显增加(图1a-b)。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、碱性磷酸酶(AP)和胆红素水平升高,肝损伤增加(图1c)。肝切片H&E和CD45免疫组织化学染色显示,NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出明显的免疫细胞浸润(图1d)。天狼星红(SR)染色以及促纤维化基因Tgfβ和Collagen1a1的mRNA表达水平证实肝纤维化(图1d-e)。肝切片染色显示NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠均表现出明显的免疫细胞浸润(图1d)。然而,与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中CD11b+细胞数量显著增加(图1f)。相反,当NLRP6缺失时,CD8+ T细胞减少(图1f)。值得注意的是,WT小鼠中NLRP6的缺失不足以导致肝损伤、炎症或纤维化(图1)。
如前所述,在NEMO缺失的情况下,经典NF-kB通路的激活所导致的肝细胞死亡是由于抗凋亡基因表达缺失。因此,本研究聚焦肝脏炎症如何影响小鼠的细胞死亡和代偿性增殖。虽然肿瘤组织中促炎细胞因子Tnfa、Il6、Il1β以及炎性小体成分Caspase-1和Nlrp3的mRNA表达水平保持不变,但在没有肿瘤的整个肝组织中,髓系CD11b+细胞浸润与促炎细胞因子Tnfa、Tlr4、Il1β、Nlrp3和Ccl5的高表达密切相关(图1g)。先前的研究表明,NLRP6的缺失会导致NLRP327的过度激活。虽然Nlrp3 mRNA表达水平增加,但我们无法在蛋白质水平上证实这一点(补充图1e, f)。此外,Nlrp3基因表达在早期13周时间点没有变化,表明在NLRP6缺失的情况下,Nlrp3炎性小体过表达并不会介导观察到的表型(补充图1g)。52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的炎症表型与pJNKd的显著激活相关(图1h),这与裂解Caspase3染色和代偿性增殖显示的凋亡性肝细胞死亡增加相关(图1i-j)。综上,这些结果表明NLRP6缺失重塑NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肿瘤微环境的炎症反应,并推动肝脏疾病向纤维化和癌症发展。
来自杂合Nlrp6+/-亲代的WT和Nlrp6-/-同窝仔,在断奶后分别在无特定病原体(SPF)条件下至少繁殖3代,以促进Nlrp6-/-小鼠中失调菌群的发展。后续利用这些雄性小鼠研究肠道菌群失调对脂肪性肝炎进展的影响。采用16S rRNA基因扩增子测序分析13周龄和52周龄NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠以及对照组WT和Nlrp6-/-小鼠的盲肠微生物群组成。首先,基于Bray-Curtis差异比较了13周龄和52周龄小鼠之间的β多样性,即小鼠之间肠道菌群组成的差异。为评估基因型(WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)、饲养笼、NEMO基因型(WT,Nlrp6-/- vs NEMOΔhepa,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)以及小鼠品系(Nlrp6-/-,NEMOΔhepa/Nlrp6-/- vs WT,NEMOΔhepa)对组间微生物组成差异的相对贡献,我们进行了置换多变量方差分析(ADONIS)。基因型、饲养笼、NEMOΔhepa基因型和小鼠品系解释了13周龄小鼠中微生物群总变异的很例(图2a)。这些分析结果也表明了显著的饲养笼效应。将基因型和饲养笼纳入ADONIS分析,基因型仍然可以解释微生物群总变异的很大一部分(R=0.296,p =0.003)。NEMOΔhepa和NEMOfl/fl,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和NEMOfl/fl/Nlrp6-/-同窝小鼠同笼饲养,NEMO条件性缺失以及所导致的脂肪性肝炎对肠道微生物群组成仍有可重复的影响。β多样性分析证实了Nlrp6-/-品系中独特的微生物群,这解释了微生物群总变异的16%(图2a)。
基于DESeq2和LEfSe进行差异丰度分析,结果显示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Muribaculum丰度相对增加,而Verrucomicrobiaceae和Lachnospiraceae中几种菌显著减少(图2b-c)。所有组进行成对比较显示,与WT小鼠相比,Nlrp6-/-小鼠中Roseburia和Lachnospiraceae减少。与WT同窝小鼠相比,NEMOΔhepa中Akkermansia增加,而此菌在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中完全消失。这些细菌在13周龄和52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中均不存在,可在LEfSe分析中区分NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠(图3c)。接下来,分析了不同基因型小鼠的肠组织切片,以探索菌群变化对肠道功能的影响。A. muciniphila可降解粘蛋白,与粘液层的增厚和肠道屏障的改善有关。因此,我们分析了结肠粘液层,结果显示NLRP6的缺失与结肠粘液层变薄相关,且在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中最为明显。通过对肠道不同部位的紧密连接蛋白ZO-1进行免疫荧光染色,探究肠道屏障功能。与WT小鼠相比,52周龄NEMOΔhepa小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠中ZO-1的表达降低(图2d)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中ZO-1进一步减少,在回肠和结肠最为明显。与NEMOΔhepa小鼠相比,52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回肠和结肠组织裂解物中闭锁蛋白表达降低(图2e,f)。然而,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠显示出ZO-1进一步减少,这在回肠和结肠中最为明显。与NEMOΔhepa小鼠相比,52周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回肠和结肠组织裂解物中occludin蛋白表达降低(图2e, f)。有趣的是,TJ屏障的破坏与炎症基因(如Il1β、Il18、Mcp1和Ccl5)的mRNA表达增加以及回肠组织中CD11b+细胞浸润增加有关(图2g)。总之,这些结果显示NLRP6表达缺失所引起的肠道生态失调促使肠道TJ屏障破坏,炎症基因表达增加。
接下来,我们研究了NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠道生态失调和肠道屏障损伤对肠道功能的影响。与NEMOΔhepa对照相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肠通透性明显增加(图2h)。值得注意的是,ALT水平和肿瘤数量与肠道通透性密切相关(图2i),表明肠道屏障受损加剧NEMOΔhepa小鼠的肝脏疾病。
13周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝组织中白细胞浸润增加,SR染色显示肝纤维化加重,Ki67免疫组织化学(IHC)染色表明肝细胞增殖增加(图3a-b)。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的ALT、AST和GLDH水平显著增加,表明肝损伤更为严重(图3c);且NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝脏/体重比显著增加。星状细胞可触发HCC发展过程中的上皮-间质转化。与NEMOΔhepa小鼠相比,aSMA染色显示13周龄NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠星状细胞活化增加。然而,没有证据表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中hedgehog信号激活增加(补充图3f)。肠道生态失调和屏障受损促进MAMPs通过门静脉进入肝脏,从而激活由病原体识别受体(PRR)介导的先天免疫反应。与NEMOΔhepa小鼠相比,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中CD45+白细胞浸润显著增加(图3d-e)。与NEMOΔhepa相比,流式细胞术分析(FACS)显示髓系抑制性细胞(CD45+CD11b+Ly6G-Gr1hi)以及CD11b+Ly6G+细胞浸润显著增加(图3f)。值得一提的是,mMDSC丰度与ALT水平密切相关,表明它们介导NEMOΔhepa小鼠肝损伤(图3g)。mMDSC在肿瘤发展中对T细胞具有明显抑制效应,NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中细胞毒性CD8+ T细胞(CD45+CD3+CD8+)和CD4+ T细胞(CD45+CD3+CD4+)明显减少(图3h)。mMDSC丰度与细胞毒性T细胞呈负相关(图3i)。其他免疫细胞亚群,如Kupffer细胞、NK/NKT细胞和B细胞保持不变。此外,在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中观察到M2标志物Arg1表达增加,而M1标志物Nos2表达降低,表明这些小鼠中存在促肿瘤微环境。
为探究肠道微生物群是否影响NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝脏中炎症反应,我们利用广谱抗生素(ABx)组合处理8周龄小鼠直至第13周。抗生素处理导致肠道菌群几乎完全清除。值得注意的是,ABx处理后NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝转氨酶水平与NEMOΔhepa小鼠相似,并且与未处理小鼠相比显著降低(图4a)。重要的是,ABx处理导致mMDSC显著降低,FACS证明了这一点,同时也反映在IF染色中CD11b+细胞的数量减少(图4b,c)。相反,ABx处理导致CD8+ T细胞和CD4+ T细胞扩增,几乎达到NEMOΔhepa小鼠肝脏中的水平(图4b)。
由于NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肠道生态失调会损害肠道屏障功能,从而促进PRRs的激活,我们测试了TLR4是否参与FMT介导的mMDSCs增殖。利用NEMOΔhepa/Tlr4-/-作为受体小鼠,将NNEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-肠道菌群转移到同窝受体小鼠中。与移植NEMOΔhepa肠道菌群相比,移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-肠道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠,其肝损伤并未增加,血清AST和ALT水平以及mMDSC丰度保持不变(图4i-j)。与TLR4参与mMDSC扩增一致,8周龄和52周龄的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠mMDSC丰度降低。这一观察结果也与肝转氨酶水平降低、细胞死亡和增殖减少以及52周龄小鼠的肿瘤负荷降低相关。此外,mMDSC丰度降低与CD3+CD4+ T细胞增加有关。为了确定这种免疫表型是由造血细胞还是实质细胞介导,我们进行了骨髓移植实验。与接受WT骨髓的NEMOΔhepa小鼠相比,接受Tlr4-/-供体骨髓的嵌合小鼠显示出mMDSC丰度显著降低了6倍以上,表明造血细胞中TLR4参与上述免疫表型调控。总。
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