科研 徐医大:郑葵阳、于英华和黄旭枫教授就膳食纤维缺乏经由肠-脑轴引起认知功能障碍发表新研究(国人佳作)
背景:认知障碍是日益严重的心理健康问题,是脑衰老和神经退行性疾病的核心特征。特别是在工业化国家,人们的膳食纤维摄入量显著减少,但人们对低纤维摄入量和认知障碍之间的潜在联系知之甚少。最新研究报告称,西方人群肠道微生物多样性显著降低。然而,目前尚不清楚缺乏纤维的饮食(改变肠道菌群)是否会通过肠-脑轴损害认知和大脑功能。
结果:在本研究中,长期(15周)膳食纤维缺乏(FD)的小鼠模型被用来模拟人类持续的低纤维摄入量。结果发现FD小鼠表现出认知障碍,如物体位置记忆、时序记忆和日常生活活动能力下降。FD小鼠海马突触超微结构受损,突触间隙增宽,突触后密度变薄。海马蛋白质组分析进一步发现,FD小鼠中CaMKIId及其相关突触蛋白(包括GAP43和SV2C)减少,并伴有神经炎症和小胶质细胞吞噬突触。FD小鼠也表现出肠道菌群失调(Bacteroidetes减少,Proteobacteria增加),这与认知障碍显著相关。值得注意的是,在认知障碍前进行短期FD饮食(7天)的小鼠中,观察到微生物群的快速变化,这强调了肠道微生物群对认知结果的可能因果影响。此外,FD饮食破坏了肠道屏障,减少了短链脂肪酸(SCFAs)的产生。我们将这些发现用于SCFA受体敲除小鼠和SCFA补充实验,证实SCFA在改变的肠道菌群和认知障碍之间起着关键作用。
结论:本研究首次报道,缺乏纤维的饮食会通过改变肠道菌群-海马轴导致认知障碍,这在病理上与正常的大脑衰老不同。这些发现说明了膳食纤维缺乏对大脑功能的不利影响,并强调增加纤维摄入量可以作为一种营养策略,以降低与饮食相关的认知能力下降和神经退行性疾病的风险。
在15周的FD饮食后,小鼠表现出显著的认知缺陷,包括物体位置记忆、时序记忆和日常生活活动能力受损(图1A-F)。与对照组相比,FD小鼠在物体位置测试中的位置识别指标和时序记忆测试中的时序识别指数均显著降低(p<0.05,图1A-D)。FD组和对照组在物体位置和时序记忆上的差异不是由于日常活动的可变性,因为两组在测试阶段对物体的总探索时间具有可比性(图S1A和B)。在筑巢行为测试中,FD组表现出筑巢能力下降,因为与对照组相比,这些小鼠的未破坏巢重量更高,执事巢评分更低(p<0.05;图1E,F和S1C)。海马突触超微结构的可塑性是认知所必需的。透射电镜显示,FD小鼠海马CA1区突触超微结构发生改变。FD小鼠突触间隙增宽,突触后密度变薄(p<0.05,图1G-I)。此外,FD组的突触前和突触后标记物,突触素(SYN)和突触后密度蛋白95(PSD95)均降低(p<0.05,图1J,K)。此外,15周后,FD组的能量摄入量、体重和脂肪组织重量均高于对照组(图S1D-F)。
图1 15周的膳食纤维缺乏可促进认知障碍和突触超微结构的改变。采用物体位置、时序记忆和筑巢测试评估小鼠的认知能力(A-F)(n=15)。A,B物体位置测试。A花在新位置物体上的时间占总物体探索时间的百分比。B SMART视频跟踪系统在测试阶段记录的Con和FD组的代表性轨迹图。蓝点和十字符号表示在测试阶段保留在旧位置和移动到新位置的物体。C,D时序记忆测试。C识别率。D SMART视频跟踪系统在测试阶段记录的Con和FD组的代表性轨迹图。蓝点和十字符号分别表示在测试阶段的熟悉的旧物体和最近熟悉的物体。E,F巢筑试验用于评估小鼠日常生活活动。E未破坏巢重量。F Con和FD组的代表性巢。G不同饮食喂养小鼠的海马CA1区突触的电镜超微结构(比例尺:500 nm)。第二行放大后的图像为第一行在虚线框标示的区域(比例尺:200 nm)。H,I突触间隙宽度和PSD厚度的图像分析(n=3)。PSD:突触后密度; SC:突触间隙; SV:突触囊泡。J,K海马区SYN和PSD95蛋白水平(n=6)。值为平均值±SEM;*p<0.05纤维缺乏组(FD) vs.对照组(Con)。
为了鉴定与纤维缺乏引起的认知障碍有关的海马突触蛋白,我们使用基于质谱的蛋白质组学分析比较了FD小鼠和对照组小鼠的海马蛋白质组。FD组有68个蛋白下调,92个蛋白上调(图2A)。GO分析用于确定与这些蛋白相关的前10个生物过程(图2B),这些信号通路包括G蛋白偶联受体信号通路、细胞发育、顺行跨突触信号通路、细胞胺代谢过程调控和跨突触信号通路。利用KEGG通路进一步分析改变的蛋白,并将其划分为下调的突触发生通路,包括胆碱能突触、多巴胺能突触、细胞粘附分子、γ-氨基丁酸(GABAergic)能突触、神经活性配体-受体相互作用、和细胞外基质(ECM)-受体相互作用通路(所有p0.05,图2C)。关于上调的通路,KEGG通路分析显示了ECM受体相互作用、糖尿病晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号通路、非洲锥虫病和Epstein Barr病毒感染(所有p0.05,图2C)。
FD小鼠与对照组小鼠海马区突触发生通路内的31种蛋白表达存在差异(图2D)。FD饮食诱导的突触蛋白改变被定位到蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络中(图2E)。PPI网络表明钙/钙调素依赖性蛋白激酶II delta(CaMKIId或CaMK2d)是胆碱能突触和多巴胺能突触通路之间的核心节点。CaMKIId直接与两条突触通路中的腺苷酸环化酶5(ADCY5)、溶质载体家族6成员3(SLC6A3)、G蛋白亚基4(GNG4)和胆碱乙酰转移酶(CHAT)以及其他突触蛋白相互作用,例如A激酶锚定蛋白5(AKAP5)(一种突触后支架蛋白)和肌动蛋白(ACTN)2(介导脊柱形态和突触后密度的组装)。CaMKIId还与一些参与突触可塑性和认知功能的蛋白间接相互作用,如生长相关蛋白(GAP)43(轴突和突触前终端的关键成分)和突触囊泡糖蛋白2V(SV2C)(定位于突触囊泡的膜糖蛋白),这两种突触蛋白在痴呆患者中也会减少。接下来,在蛋白质组学分析中检测到的显著变异在海马区中使用免疫印迹进行验证。我们发现,与对照组相比,FD组海马区CaMKIId、GAP43和SV2C蛋白水平降低(p0.05;图2F-H)。总体上,蛋白质组学结果表明,CaMKIId及其相关突触蛋白的失调导致了纤维缺乏引起的突触和认知损伤。
图2 15周的膳食纤维缺乏改变了海马突触蛋白质组。A-E海马全蛋白质组定量分析(n=3)。A差异表达蛋白的火山图。B分析GO富集生物过程中差异表达蛋白。C差异表达突触蛋白的KEGG通路分析。D差异表达突触蛋白的热图。E基于STRING数据库和Cytoscape 3.6.0进行明显失调蛋白的PPI网络分析。黑线表示两种蛋白质之间的相互作用。红色节点表示上调,蓝色节点表示下调。F-H通过western blot对下调的海马全蛋白组(CaMKIId、GAP43和SV2C)进行定量分析(n=5-6)。数值为平均值±SEM;*p<0.05纤维缺乏组(FD) vs.对照组(Con)。
为了阐明小胶质细胞如何调节突触连接,我们对FD小鼠小胶质细胞的形态进行了表征,并研究了小胶质细胞-突触吞噬作用。通过用Iba1抗体(一种小胶质细胞特异性钙结合蛋白)进行免疫荧光染色,我们发现FD小鼠海马CA1、CA3区和DG中的小胶质细胞数量增加、小胶质细胞体增大、小胶质分支数量减少(图3A,B),以及Iba1蛋白水平增加(p0.05,图3C)。对Iba1+细胞的Sholl分析显示,FD组中激活的小胶质细胞增加,表现为循环指数增加和分支指数降低(p0.05;图3D,E)。此外,我们发现FD小鼠海马区促炎细胞因子、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的水平增加(p0.05,图3F),表明促炎M1激活。FD组小胶质细胞中CD68(吞噬标记物)的免疫荧光强度上调(图3G),海马区mRNA和蛋白水平升高 (p0.05,图3H,I)。FD组小胶质细胞包裹的PSD阳性斑点增加(图3J),表明膳食纤维缺乏可激活小胶质细胞,并诱导吞噬海马区突触。在观察到纤维缺乏引起的神经炎症之后,我们发现FD小鼠的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)增加(p0.05,图3K),这是一种将炎症与突触改变交联的重要介质。PTP1B可以抑制CaMKII的激活,并损害pCaMKIIpGSK3β突触发生通路,导致Tau磷酸化,它是几种神经退行性疾病的关键标志。与这些发现一致,我们观察到膳食纤维缺乏会降低pCaMKII和pGSK3β的水平(p0.05,图3L,M)并上调pTau(p0.05,图3N)。综上所述,这些结果表明,纤维缺乏诱导小胶质细胞激活介导的突触吞噬,并改变海马突触信号分子。
肠道内稳态对大脑功能很重要。我们检测了纤维缺乏是否扰乱了肠道内环境稳态,包括肠道屏障完整性、通透性、炎症和肠道微生物群。使用阿尔新蓝染色,我们发现,与对照组相比,FD组结肠粘液层的厚度减少(p0.05,图4A,B),这通过内粘液层MUC2染色得到证实(图4C)。FD组小鼠结肠组织中抗菌肽Reg3γ mRNA表达降低(p0.05,图4D)。FD组微生物群与上皮组织的距离较短(图4E),表明细菌聚集和粘液浸润。此外,FD小鼠显示出较低水平的上皮紧密连接蛋白、occludin和zonula occludens-1 (ZO-1)(p0.05,图4F)和较高水平的粪便白蛋白、血清LPS(p0.05,图4G,H),表明上皮屏障完整性受损和肠道通透性增加。此外,FD组的肠道炎症和全身炎症增加,因为FD小鼠结肠(p0.05,图S1G)和血清(p0.05,图S1H)中的TNFα、IL-6和IL-1β mRNA表达增加。FD饮食后结肠长度缩短(图4I)。
接下来,利用16S rRNA基因测序分析纤维缺乏对肠道微生物多样性和组成的影响。主成分分析(PCoA)显示出相对分离的分布格局,说明FD组与对照组的微生物群落β-多样性存在明显差异(图4J)。在α多样性方面,纤维缺乏显著降低了Chao1、Ace和Sob指数(p0.05,图S2A-C),但不包括Shannon物种多样性指数(图S2D)。在门水平上,对照组和FD小鼠肠道微生物群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)组成(图4K)。与对照组相比,FD小鼠中拟杆菌门显著减少,而变形菌门显著增加(p<0.05,图4L)。利用LEfSe分析发现,拟杆菌门中的细菌类群也有所减少,如拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、S24-7科和Prevotella属(图4M和图S2E)。而FD小鼠则增加了变形菌门中类群的富集,包括δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和单胞菌目(Xanthomonadales)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和单胞菌科(Xanthomonadaceae)、嗜胆菌属(Bilophila)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(图4M和图S2E)。此外,我们发现拟杆菌门和变形杆菌门中改变的微生物与物体位置、时序和筑巢行为测试的认知指标显著相关(图4M)。这些结果强烈表明,拟杆菌门和变形杆菌门肠道菌群的宿主特异性改变是纤维缺乏小鼠认知功能下降的标志。此外,使用KEGG注释和功能富集,我们确定了18个功能类别,它们在FD组和对照组之间表现出不同的富集水平(图S2F)。FD组中与氧化磷酸化相关的功能降低(图4N)。KEGG通路分析还表明,膳食纤维缺乏引起的肠道菌群失调与微生物代谢能力下降有关(图S2F。
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