糖尿病是以糖代谢紊乱及体液失衡为主要表现的疾病,可由遗传因素及环境因素共同导致,并随着疾病进展合并其他器官疾病,致残率、致死率均较高。
2型糖尿病(diabetesmellitustype2,T2DM)是糖尿病发病主要类型,当前全球约有2亿患者,新增患者主要集中在发展国家,给患者造成极大危害,同时也增加了经济负担。
胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)是T2DM的发病机制之一,胰岛素代谢反应减低导致机体血糖居高不下,加重糖代谢紊乱,不利于病情稳定。
内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)是一种适应性保护调节作用,可通过增加内质网的折叠能力减少损伤蛋白质从而恢复其稳态性。
T2DM属于一种低炎症疾病,肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor,TNF)和单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,MCP-1)是参与T2DM发展的主要炎症介质,高糖对肾脏组织造成损伤,肾脏固有细胞分泌TNF-α等炎症因子,增加了炎症联级反应及机体损伤。
中医学在T2DM治疗中逐渐发挥重要作用,中医将T2DM归属为“消渴”范畴,可采用补脾肾、化痰浊及清肺胃的药物治疗。
黄连化浊胶囊又称黄金胶囊,具有清热解毒、运脾化浊等功能,已证实具有调节脂质代谢提高胰岛素敏感性的作用。
本文通过建立T2DM大鼠模型探讨黄连化浊胶囊对ERS、IR及MCP-1/TNF-α的作用,为相关研究提供参考依据。
60只SPF级SD雄性大鼠,5~6周龄,体重(250±50)g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,动物生产许可证号:SCXK(鲁)20190003,大鼠饲养于我院附属大学实验动物中心SPF级实验动物房,湿度为55%~60%,温度25℃,模拟黑白交替无菌饮食14d,每5只大鼠1个笼子,定时清洗、消毒鼠笼。
黄连化浊胶囊(黄连9g,鸡内金12g,法半夏9g,竹茹15g,枳实9g,陈皮9g,茯苓15g,炙甘草9g),甘肃中医药大学附属医院院内药剂(批准文号:甘药制字Z120110),批号171103。
链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),北京索莱宝科技有限公司;4%四聚甲醛,默克生命科学技术(南通)有限公司;磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline,PBS),康迪斯化工(湖北)有限公司;H-E染色试剂盒,南京建成生物工程研究所;免疫组化试剂盒、ECL化学发光液、酶联免疫试剂盒、BCA蛋白定定量试剂盒,上海酶联生物科技有限公司;GRP78、醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)抗体,GeneTex公司;MCP-1单抗、TNF-α单抗,上海复申生物科技有限公司。
DA7600实时荧光定量PCR仪,中山大学达安基因股份有限公司;伯乐ChemiDocMP化学发光凝胶成像系统,Bio-Rad公司;IX71型倒置拍照显微镜,上海赖氏电子科技有限公司;电泳仪,北京六一仪器厂。
60只SPF级SD雄性大鼠分为对照组、糖尿病组、黄连化浊胶囊低剂量组、黄连化浊胶囊中剂量组、黄连化浊胶囊高剂量组及双胍干预组,每组10只。
大鼠建模:对照组正常饲料喂养,其余5组大鼠均以高脂饲料喂养6周,空腹饲养6h后腹腔每日单次注射60mg/kg的STZ,连续注射3次建立T2DM大鼠模型。
连续3次采集尾部静脉血,当空腹血糖≥11.1mmol/L-1、餐后2h血糖≥16.7mmol/L-1为建模成功,本实验所有大鼠均建模成功。
黄连化浊胶囊组按照人与大鼠体表面计算及文献灌胃相应药物剂量,高剂量为2.025g/kg,中剂量为1.265g/kg,低剂量为0.675g/kg;双胍干预组灌胃0.2g/kg的二甲双胍;对照组及糖尿病组灌胃体积相同的生理盐水,每日1次,连续10周。
各组大鼠均建模成功,无死亡大鼠,灌胃期间对照组继续采用正常饲料喂养,其余大鼠继续采用高脂饲料喂养。
治疗前后禁食12h,采用1%戊巴比妥钠以40mg/kg剂量进行腹腔,取腹主动血5ml,3ml以3500r/min离心15min(离心半径12cm),血清于-20℃中保存待检。
采用放射免疫方法检测血清中空腹胰岛素(fastingserumlisulin,FINS),严格按照试剂盒说明书进行。
胰腺组织取入10%甲醛溶液中固定,纵向切片,放入脱钙剂中脱钙,后石蜡包埋切片厚度4μm,低温保存。
取4μm石蜡切片,放入37℃复温15min,二甲苯脱蜡后梯度乙醇脱水,苏木精染色10min,盐酸(质量分数为1%)处理,伊红复染,脱水中性树脂封片,观察组织形态。
提取胰腺石蜡包埋切片,逐层乙醇脱水,加入PBS冲洗5min,重复3次,加入20μg/mL的蛋白酶K溶液,在23℃下孵育30min,PBS冲洗后放入3%的H2O2,15min后再次用PBS冲洗,擦片后放入50μL的TUNEL反应液,37℃下孵育60min。
PBS冲洗,加入50μL转化剂过氧化物酶(peroxidase,POD),用抗荧光淬灭封片液封片后观察。
凋亡细胞呈现荧光绿色,每张切片选择5个非重叠视野,计算胰岛β细胞凋亡率(凋亡/总细胞×100%)。
次日60℃下恒温保存40min,放入二甲苯中脱蜡,再次进行梯度乙醇透水,蒸馏水浸泡5min。
微波炉加热进行抗原修复,沸腾后加热60s、闷5min,重复上述做法2次,冷却到室温,PBS洗涤。
PBS洗涤3次,采用山羊血清封闭20min,在4℃冰箱中孵育过夜,加入GRP78(1∶200)、ATF6(1∶150)一抗,加入生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗(1∶1000)10min,PBS冲洗3次,加入DAB显色剂,苏木精复染40s,清水返蓝30s,中性树胶封片,随机选择5个视野计算阳性细胞数。
胰腺组织采用PBS冲洗后切碎,加入1mL的细胞裂解液,10000×g 4℃离心5min,取上清液,加入样孔中,采用BCA法测总蛋白浓度,每孔上样蛋白量20μg,进行SDS-PAGE。
转印缓冲液配制好后要放入4℃冰箱内预冷,然后全部转移到PVDF膜上,加入脱脂奶粉,全程封闭1h。
采用GraphPadPrism8软件分析,所有数据符合正态分布,采用x±s表示,组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。
治疗前各组大鼠体重、FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
治疗后,与对照组相比,糖尿病组大鼠FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平均升高、体重降低(P<0.05);与糖尿病组相比黄连化浊胶囊低剂量组差异无统计学意义(P>0.05),黄连化浊胶囊中、高剂量组及双胍干预组FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平均降低、体重升高(P<0.05);与黄连化浊胶囊中剂量组相比,黄连化浊胶囊高剂量组FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平均降低、体重升高(P<0.05);黄连化浊胶囊高剂量组与双胍干预组体重、FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平差异均无统计学意意义(P>0.05)。
糖尿病组大鼠胰岛明显萎缩,无法清晰观察到胰岛细胞界限,细胞形态不规则且排列紊乱,胰岛间质中出现大量空泡,可见严重炎症浸润。
与糖尿病组比较,黄连化浊胶囊低、中及高剂量组及双胍干预组胰岛形态及功能均出现不同程度的改善,其中高剂量组最佳,细胞数目增多,形态改善,无炎性浸润。
对照组、糖尿病组、黄连化浊胶囊低、中、高剂量组及双胍干预组的胰岛β细胞凋亡率分别为(2.02±0.85)%、(24.02±6.12)%、(18.78±4.55)%、(15.56±4.15)%、(10.25±3.36)%及(10.60±3.50)%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。
与对照组比较,糖尿病组胰岛β细胞凋亡率升高(P<0.05);与糖尿病组相比,黄连化浊胶囊低、中、高剂量组级双胍干预组胰岛β细胞凋亡率均降低(P<0.05);黄连化浊胶囊3个剂量组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);黄连化浊胶囊高剂量组与双胍干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
与对照组比较,糖尿病组GRP78及ATF6阳性细胞数均升高(P<0.05);与糖尿病组相比,黄连化浊胶囊低、中、高剂量组级双胍干预组GRP78及ATF6阳性细胞数均降低(P<0.05);黄连化浊胶囊3个剂量组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);黄连化浊胶囊高剂量组与双胍干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
与对照组比较,糖尿病组MCP-1、TNF-α蛋白水平升高(P<0.05);与糖尿病组相比,黄连化浊胶囊低、中、高剂量组及双胍干预组MCP-1、TNF-α蛋白水平均降低(P<0.05);黄连化浊胶囊低、中剂量组间差异无统计学意义(P>0.05),与黄连化浊胶囊中剂量组相比高剂量组MCP-1、TNF-α蛋白水平降低,但高剂量组与双胍干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
糖尿病的发病机制以IR及胰岛β细胞功能缺陷为主要致病机制,胰岛β细胞功能缺陷可推动疾病发生、发展。
T2DM大鼠建模过程与人类T2DM疾病存在相似性,长期食用高脂高糖饲料会产生糖脂代紊乱,导致IR,注射STZ后造成胰岛β细胞损伤。
本文研究结果显示,糖尿病组大鼠血糖升高及IR显著,采用黄连化浊胶囊干预后均降低,说明其可改善IR而发挥降低血糖、增加体重的作用。
二甲双胍是T2DM的一线治疗药物,可通过激活腺苷酸激活蛋白酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)信号通路抑制肝脏糖异生及脂肪合成,加快肌肉对糖分利用,同时可调控胰高糖素样多肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)分泌,改善胰岛素抵抗,达到降低血糖的目的。
枳实味苦,性寒,归胃、脾经,破气、痰化、痞胀消,陈皮味苦、辛,性温,归肺、脾经,理气健脾,燥湿化痰。
茯苓味甘、淡,性平无毒,归心、脾、肺,肾四经,利水渗湿、脾虚泄泻、痰湿入络;炙甘草味甘气温,调和诸药,全方共奏清热解毒、运脾化浊之效。
现代药理学表明,黄连化浊胶囊中黄连及鸡内金均具有抗氧化能力,黄连中小檗碱可促进胰岛素分泌而改善IR,鸡内金具有调节血糖血脂的作用,降低肝脏中脂肪累积,提高胰岛素敏感性。
康学东等研究表明,黄金胶囊灌胃后可改善T2DM大鼠IR,提高胰岛素敏感性,发挥降低血糖的功效。
GRP78是ERS中主要的分子伴侣蛋白,也是内质网发生的标志蛋白,在正常生理状态下其与下游3个受体及ATF6形成稳定结构,ERS发生后ATF6从结构中解离转到高尔基上,被蛋白酶S1p及S2p切割后参与ERS相关蛋白的转录及表达。
本文研究结果显示,黄连化浊胶囊灌胃后大鼠的胰岛β细胞凋亡率降低,同时ERS标志蛋白GRP78及ATF6水平也有所降低,说明其可以减少胰腺ERS、抑制胰岛β细胞的凋亡。
黄连化浊胶囊臣药黄连中主要药理成分小檗碱能够抑制GRP78水平,改善应激反应,缓解T2DM胰腺损伤。
詹玫琦等研究发现,中药黄连能够降低T2DM大鼠血脂紊乱水平、抑制胰腺脂毒性与降低ERS蛋白GRP78、CHOP、ATF4的表达相关。
高血脂大鼠中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1等炎症因子表达均升高,采用黄连半夏可通过抑制核因子κB活性降低TNF-α及MCP-1等炎症因子表达,从而减少机体氧化应激损伤,推测其可以通过抑制炎症因子激活改善ERS损伤,减少胰岛β细胞凋亡,提高胰岛素敏感性,降低血糖。
综上所述,黄连化浊胶囊可降低T2DM模型大鼠血糖水平,降低IR,同时改善胰腺ERS,减少胰岛β细胞的凋亡,其机制可能与抑制MCP-1、TNF-α蛋白表达水平相关。
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