从部分样品中观察到自发荧光(AF),但信号强度远低于本研究中讨论的蛋白质信号。还评估了对靶蛋白不具有特异性的抗体的结合。证实非特异性抗体中没有IF信号。
肾结石形成的发病机制包括涉及矿物成分和蛋白质基质之间复杂相互作用的多步骤过程。肾结石中的钙结合蛋白对结石的形成有很大的影响。这些蛋白质在肾结石中的空间分布对于评估蛋白质对结石形成的体内影响至关重要,尽管这些蛋白质的实际分布尚不清楚。我们揭示了三种不同蛋白质的微观分布,即骨桥蛋白(OPN),肾凝血酶原片段1(RPTF-1)和钙粒蛋白A(Cal-A),在保留原始矿物相和质地的人肾结石中:草酸钙一水合物(COM)和草酸钙二水合物(COD)。OPN和RPTF-1分布在COM和COD晶体内部,而Cal-A分布在晶体外部。OPN和RPTF-1在具有镶嵌纹理的COM晶体中表现出均匀分布,并且在COD晶体中呈周期性分布平行于特定晶面。这些蛋白质的独特分布使我们能够根据每种蛋白质的物理化学性质和每种蛋白质的复杂物理环境变化来解释每种蛋白质对CaOx晶体生长的不同体内影响。这种方法将进一步使我们能够阐明不同蛋白质对肾结石形成的体内影响。
肾结石病是一种常见的疾病,一生中至少影响一次1.7-14.8%的人口1,2.在多达 50% 的病例中,这种疾病在第一次发作后 5 年内复发。尽管这个健康问题很重要,但无法对结石形成进行预防性治疗。了解肾结石形成的发病机制对于减少肾结石疾病的发生和复发至关重要3.大约 80% 的肾结石是草酸钙 (CaOx) 结石4,5.CaOx结石由~90%的矿物相组成,即CaOx,进一步分为草酸钙一水合物[Ca(C2O4)·H2O](COM)和草酸钙二水合物[Ca(C2O4)·2H2O](COD),以及相对较少的有机物,其被视为蛋白质基质6.肾结石形成的发病机制包括涉及矿物质成分和蛋白质基质之间复杂相互作用的多步骤过程7,8.
在肾结石中鉴定出100多种蛋白质9–11.其中,已知几种蛋白质,特别是钙结合蛋白,在CaOx结石形成过程中起着至关重要的作用12–16.这些蛋白质的具体作用已经在结石形成的许多步骤中进行了深入研究,包括晶体成核、晶体生长、晶体聚集和晶体粘附,并进行了许多体外结晶研究17–19.体外研究有助于评估特定蛋白质对结石形成中特定步骤的影响。然而,在真实的结石形成环境中,蛋白质的数量同时起作用,并且蛋白质、钙离子和草酸盐浓度的尿液成分波动。这种担忧促使我们研究真正的人类肾结石,以发现蛋白质对晶体生长的真正影响。
在以前的大多数研究中,肾结石中蛋白质的鉴定都是在粉碎和提取后用质谱法进行的9–11.因此,有关结石中蛋白质空间分布的信息丢失。在非常有限的研究中,肾结石中的蛋白质鉴定已经通过肾结石切片进行,其中CaOx晶体通过脱钙完全去除20,21.这种方法有助于发现肾结石中蛋白质的分布,这可能有助于了解蛋白质对结石形成的特定影响。然而,这种方法丢失了大量记录在肾结石晶体中的结石形成信息。70多年的先前研究表明,肾结石的矿物信息的重要性可以通过鉴定晶相以及使用光学显微镜对肾结石的切片和抛光薄片进行晶体纹理分类来获得。22,23.
缺乏评估肾结石中原始CaOx晶体蛋白质分布的分析一直是理解结石形成的一个相当大的障碍。蛋白质分布和晶相/形态的协调评估可以提供有关结石形成历史的重要信息。多重免疫荧光染色(multi-IF染色)已被用于显示两种或多种蛋白质在生物样品的许多类型的软组织中的分布24.该技术在由多孔磷酸钙晶体组成的骨组织中的应用也为骨矿物质稳态的动态调节提供了重要的见解25.然而,这尚未用于研究由致密和坚硬晶体组成的肾结石,尽管单次免疫荧光染色已用于显示脱钙肾结石中特定蛋白质的分布,该蛋白质不会保留矿物质信息20,21.本研究调查了能够对保留原始矿物质信息的肾结石样本进行多中频染色的条件。我们研究了三种不同蛋白质,骨桥蛋白(OPN),肾凝血酶原片段1(RPTF-1)和钙粒蛋白A(Cal-A)在CaOx结石薄片中的分布。这些蛋白质在大多数CaOx结石中很常见,被称为钙结合蛋白,可能影响CaOx结石的形成26–28.据我们所知,这是第一个在肾结石同可视化多种基质蛋白的研究。我们根据每种蛋白质的分布、理化性质以及CaOx结石形成过程中每种蛋白质的复杂物理环境变化,进一步解释了每种蛋白质对CaOx晶体生长的不同体内影响。
基于显微镜观察和FT-IR分析,将肾结石样品的结构域分为三种类型的纹理,这些纹理与舒伯特和Brien报道的纹理一致。23:由正面体COD晶体组成的不规则纹理(类型1,称为正面体COD聚集体;无花果。1c)、由不规则取向COM晶体组成的镶嵌纹理(2型,简称马赛克COM;无花果。1f)和同心层压COM晶体(3型,称为同心COM;无花果。1大多数观察到的CaOx结石样品由这三种纹理组成(表)。(表11).
将用于生物样品的多IF染色方案应用于分析通过典型地质方法制备的肾结石样品的薄片。对于该应用,调整染色前薄切片的蚀刻条件,发现只有在典型染色过程之前对抛光的薄切片进行轻微蚀刻(用pH 6.0柠檬酸盐溶液1分钟)时,可视化才成功。多IF染色能够对三种不同宝石纹理中不同颜色的三种蛋白质(OPN:绿色,RPTF-1:蓝色和Cal-A:红色)进行共可视化。
我们发现每种蛋白质都表现出特征分布模式,具体取决于其在COM和COD中的位置。在7个样品中的15个样品中发现了正面体COD聚集体(表)(表1)。1).正面体COD聚集体主要存在于CaOx肾结石的外围(图)。(图 1a–c)。1a-c)。已知这些COD晶体具有由{101}面组成的四方双锥体形状29.许多COD双金字塔的两座金字塔的顶端也有{110}面(图)。2b 和补充图。晶体的多IF染色图像如图所示。2a,OPN周期性地出现在COD的表面{110}如图中的白色箭头所示。2c.这张脸与典型的COD体外晶体生长中没有出现的双锥尖的面相同。29.RPTF-1沿{101}面显示为平行层,具有μm尺度的间隔,如图中的箭头所示。2这种晶面是典型COD生长的特征。29.Cal-A存在于COD晶体之外,在特定表面上没有显示出优先吸附(图)。2在其他结石样品中也观察到相同的分布模式(补充图)。S2).
马赛克COM纹理是CaOx石头中最普遍的纹理(图。(图 1d–f)。1d-f)。在12个样品中的15个样本中观察到这种纹理(表)(表1)。1).马赛克COM的多IF染色如图所示。图3a,b.3a,b. OPN和RPTF-1存在于COM晶体中(图)。(图 3c,d)。3c,d)。相反,Cal-A仅沿晶界(即,在COM晶粒的表面上)存在(图)。3我们进一步分析了蛋白质的线a,详细评估每种蛋白质的分布模式(图上的黄线在晶体区域显示出较高的强度,而Cal-A在晶体区域的强度较低(图)。4b). Cal-A的高强度仅沿晶体边界观察到。尽管COM颗粒的大小和形状不同,但在许多样品中都可以看到这些蛋白质分布(补充图)。S3).
同心COM也是CaOx石头中的典型纹理(图)。(图1g–i)。1G-I)。我们在 10 个样本中的 15 个样本中发现了这种纹理(表(表1)。1).OPN、RPTF-1和Cal-A分布在同心层中(图)。5OPN和RPTF-1作为恒定层和规则层存在于COM晶体中,形成微米级间隔(图)。(图5b,c)。5b,c)。相比之下,Cal-A分布由位于石头外表面的不规则且间隔相对较宽的层组成(图)。5SEM观察显示每个Cal-A层附近有一个间隙层(图)。(图 6a,b)。6a,b)。产生间隙空间的两个表面都被微小的沉积物占据,这些沉积物与构成同心COM的主要COM晶体明显不同(图)。(图 6c,d)。6c,d)。这些蛋白质在同心COM中的线强度曲线显示每个蛋白质谱中的峰值(图)。(图 4c,d)。4c,d)。OPN和RPTF-1的分布相似(即5.58±2.70μm/层OPN和5.99±2.56μm/层的RPTF-1)(补充表S1).然而,Cal-A层的间隔明显大于OPN和RPTF-23(即17.18±57.1μm/层)。在其他9个样品中的大多数中都观察到类似的分布模式和间隔,尽管在少数样品中没有看到Cal-A层(补充图)。S4和表S1).
根据电解从石粉提取物中检测到的 OPN、RPTF-1 和 Cal-A 已知存在于 CaOx 结石中9–11.免疫细胞化学技术脱钙CaOx结石中OPN的微观分布显示,OPN在CaOx结石的同心片中分布21,30.本方法生动地可视化了三种不同蛋白质在先前认为的“有机层”中的位置(图)。7a,b)。我们在同心COM中研究中显示的OPN分布模式与先前的观察结果一致。进一步发现,RPTF-1在同心COM中的分布模式与OPN几乎相同,而RPTF-1在COD晶体中的分布与OPN的分布不同。相反,Cal-A的分布模式与其他两种蛋白质完全不同。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的这些不同微观分布记录了 CaOx 结石形成的历史。
OPN和RPTF-1均存在于正面体COD晶体、镶嵌COM晶粒和同心COM中(图)。(图2a,2一个a,3a3a 和和5a)。5这一发现证实了这些蛋白质同时掺入COD和COM晶体中。Cal-A存在于正面体COD晶体的外部和马赛克COM颗粒周围(图。(图2e2e 和和 3e)。3在同心COM的情况下,通常在Cal-A层周围发现的间隙空间表明Cal-A层不包含在晶体中,而是分布在晶体的表面上(图)。(图5d5d 和和6a-d)。6A–d)。这些分布表明OPN和RPTF-1倾向于掺入CaOx晶体中,而Cal-A几乎没有掺入。
蛋白质吸附和掺入CaOx晶体理论上受到其氨基酸侧链的结合力和各自蛋白质的其他特定性质(如静电负电荷)的影响31,32.净电荷表明OPN和RPTF-1比Cal-A带更多的负电荷,OPN,RPTF-1和Cal-A的等电点分别为3.5,2.5-3.0和6.5-7.033–35.已知OPN,RPTF-1和Cal-A具有钙结合结构域36–38.这些结构域还可以作为生长晶体表面的局部结合位点。OPN、RPTF-1 和 Cal-A 的钙结合域可分别结合 10、7 和 2 个钙离子36–38.因此,这些蛋白质对CaOx表面带正电荷的Ca的体积和局部亲和力会导致这些蛋白质在CaOx中的掺入效率不同。
晶体生长通过将生长单元合并到晶体表面上出现的步骤和扭结位点来进行39,40.蛋白质和生长晶体表面之间的三维相容性将决定蛋白质掺入晶体表面的程度。与生长扭结位点和步骤具有强结合能力的蛋白质倾向于更有效地结合到生长晶体中41–43.目前报道的三种蛋白质的分布和钙亲和力表明,OPN和RPTF-1的强亲和力有助于结合并掺入COD和COM晶体。相反,具有较低亲和力的Cal-A仅粘附在晶体表面,而不掺入晶体中。之前的一项研究表明,更多的磷酸化肽将肽掺入COM的比率更高,这支持了这一解释。43.这些讨论将使我们能够根据其钙结合特性预测许多其他蛋白质的分布。
8.结果表明,OPN和RPTF-1分别构建了对应于COD面{110}和{101}的层叠织构作为晶内蛋白,而Cal-A不包含在层压织构中(图)。(图 2c–e)。2c-e)。这种蛋白质在肾结石晶体上/肾结石晶体中表面选择性吸附/掺入的体内证据表明,蛋白质的分布与光学显微镜观察到的传统“有机物层”不同(图)。7Chien等人(2009年和2018年)报道了OPN在COD晶体上选择性吸附的体外证据。46,47.根据这些报告,OPN与COD的典型晶体{110}面结合并掺入矿物相。
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