在这篇文章中,我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上,我们将讨论当今常用的一些更高级的光学显微镜形式,并比较它们在不同应用中的优缺点。
自然界中一些最基本的过程发生在微观尺度上,远远超出了我们肉眼所能看到的极限,这推动了技术的发展,使我们能够超越这个极限。早在公元4世纪,人们发现了光学透镜的基本概念,并在13世纪,人们已经在使用玻璃镜片,以提高他们的视力和放大植物和昆虫等对象以便更好地了解他们。随着时间的推移,这些简单的放大镜发展成为先进的光学系统,被称为光学显微镜,使我们能够看到和理解超越我们感知极限的微观世界。今天,光学显微镜是许多科学和技术领域的核心技术,包括生命科学、生物学、材料科学、纳米技术、工业检测、法医学等等。在这篇文章中,我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上,我们将讨论当今常用的一些更高级的光学显微镜形式,并比较它们在不同应用中的优缺点。
什么是光学显微镜?光学显微镜用于通过提供它们如何与可见光相互作用(例如,它们的吸收、反射和散射)的放大图像来使小结构样品可见。这有助于了解样品的外观和组成,但也使我们能够看到微观世界的过程,例如物质如何跨细胞膜扩散。
显微镜的部件以及光学显微镜的工作原理从根本上说,显微镜包括两个子系统:一个用于照亮样品的照明系统和一个成像系统,该系统产生与样品相互作用的光的放大图像,然后可以通过眼睛或使用相机系统进行观察。
早期的显微镜使用包含阳光的照明系统,阳光通过镜子收集并反射到样品上。今天,大多数显微镜使用人造光源,如灯泡、发光二极管(LED)或激光器来制造更可靠和可控的照明系统,可以根据给定的应用进行定制。在这些系统中,通常使用聚光透镜收集来自光源的光,然后在聚焦到样品上之前对其进行整形和光学过滤。塑造光线对于实现高分辨率和对比度至关重要,通常包括控制被照亮的样品区域和光线照射到它的角度。照明光的光学过滤,使用修改其光谱和偏振的光学过滤器,可用于突出样品的某些特征。
成像系统收集与样品相互作用的照明光,并产生可以查看的放大图像(如上图1)。这是使用两组主要的光学元件来实现的:首先,物镜从样品中收集尽可能多的光,其次,目镜将收集的光中传递到观察者的眼睛或相机系统。成像系统还可包括诸如选择来自样品的光的某些部分的孔和滤光器之类的元件,例如仅看到已从样品散射的光,或仅看到特定颜色或波长的光。与照明系统的情况一样,这种类型的过滤对于挑出某些感兴趣的特征非常有用,这些特征在对来自样本的所有光进行成像时会保持隐藏。
总的来说,照明和成像系统在光学显微镜的性能方面起着关键作用。为了在您的应用中充分利用光学显微镜,必须充分了解基本光学显微镜的工作原理以及当今存在的变化。
单个镜头可以用作放大镜,当它靠近镜头时,它会增加物体的外观尺寸。透过放大镜看物体,我们看到物体的放大和虚像。这种效果用于简单的显微镜,它由单个镜头组成,该镜头对夹在框架中并从下方照明的样品进行成像,如下图2所示。这种类型的显微镜通常可以实现2-6倍的放大倍率,这足以研究相对较大的样本。然而,实现更高的放大倍率和更好的图像质量需要使用更多的光学元件,这导致了复合显微镜的发展(如下图3)。
在复合显微镜中,从底部照射样品以观察透射光,或从顶部照射样品以观察反射光。来自样品的光由一个由两个主要透镜组组成的光学系统收集:物镜和目镜,它们各自的功率倍增,以实现比简单显微镜更高的放大倍率。物镜收集来自样品的光,通常放大倍数为40-100倍。一些复合显微镜在称为“换镜转盘(nose piece)”的旋转转台上配备多个物镜,允许用户在不同的放大倍数之间进行选择。来自物镜的图像被目镜拾取,它再次放大图像并将其传递给用户的眼睛,典型的目镜放大率为10倍。
可以用标准光学显微镜观察到的最小特征尺寸由所使用的光学波长(λ)和显微镜物镜的分辨率决定,由其孔径数值(NA)定义,最大值为NA =1空中目标。定义可区分的最小特征尺寸(r)的分辨率极限由瑞利准则给出:
例如,使用波长为550nm的绿光和典型NA为0.7的物镜,标准光学显微镜可以分辨低至0.61×(550nm)/0.7≈480nm的特征,这足以观察细胞(通常为10µm大小),但不足以观察较小生物的细节,例如病毒(通常为250-400nm)。要对更小的特征成像,可以使用具有更高NA和更短波长的更先进和更昂贵的物镜,但这可能不适用于所有应用。
在标准复合显微镜(如下图4a)中,样品(通常在载玻片上)被固定在一个可以手动或电子移动以获得更高精度的载物台上,照明系统位于显微镜的下部,而成像系统高于样本。然而,显微镜主体通常也可以适应特定用途。例如,立体显微镜(如下图4b)的特点是两个目镜相互成一个小角度,让用户可以看到一个略有立体感的图像。在许多生物学应用中,使用倒置显微镜设计(如下图4c),其中照明系统和成像光学器件都在样品台下方,以便于将细胞培养容器等放置在样品台上。最后,比较显微镜(如下图4d)常用于法医。
图4:复合显微镜。a)标准直立显微镜指示(1)目镜,(2)物镜转台、左轮或旋转鼻镜(用于固定多个物镜),(3)物镜、调焦旋钮(用于移动载物台)(4)粗调,(5)微调,(6)载物台(固定样品),(7)光源(灯或镜子),(8)光阑和聚光镜,(9)机械载物台。b)立体显微镜。c)倒置显微镜。
光学显微镜的类型下面,我们将介绍一些当今可用的不同类型的光学显微镜技术,讨论它们的主要操作原理以及每种技术的优缺点。
亮视野显微镜(Brightfield microscopy,BFM)是最简单的光学显微镜形式,从上方或下方照射样品,收集透射或反射的光以形成可以查看的图像。图像中的对比度和颜色是因为吸收和反射在样品区域内变化而形成的。BFM是第一种开发的光学显微镜,它使用相对简单的光学装置,使早期科学家能够研究传输中的微生物和细胞。今天,它对于相同的目的仍然非常有用,并且还广泛用于研究其他部分透明的样品,例如透射模式下的薄材料(如下图5),或反射模式下的微电子和其他小结构。
暗视野显微镜是一种仅收集被样品散射的光的技术。这是通过添加阻挡照明光直接成像的孔来实现的,这样只能看到被样品散射的照明光。通过这种方式,暗场显微镜突出显示散射光的小结构(如下图6),并且对于揭示BFM中不可见的特征非常有用,而无需以任何方式修改样品。然而,由于在最终图像中看到的唯一光是被散射的光,因此暗场图像可能非常暗并且需要高照明功率,这可能会损坏样品。
相差显微技术(Brightfield microscopy,PCM)是一种可视化由样品光路长度变化引起的光学相位变化的技术.这可以对在BFM中产生很少或没有对比度的透明样品进行成像,例如细胞(如下图7)。由于肉眼不易观察到光学相移,因此相差显微镜需要额外的光学组件,将样品引起的相移转换为最终图像中可见的亮度变化。这需要使用孔径和滤光片来操纵照明系统和成像系统。这些形状和选择性地相移来自样品的光(携带感兴趣的相位信息)和照明光,以便它们建设性地干涉眼睛或检测器以创建可见图像。
与PCM类似,微分干涉显微镜(differential interference contrast microscopy,DICM)通过将由于样品光路长度变化引起的光学相位转换为可见对比度,从而使透明样品(例如活的未染色细胞)可视化。然而,与PCM相比,DICM可以实现更高分辨率的图像,并且减少了由PCM所需的光学器件引入的清晰度和图像伪影。在DICM ,照明光束被线性偏振器偏振,其偏振旋转,使其成两个偏振光束,它们具有垂直偏振和小(通常低于1µm)间隔。穿过样品后,两束光束重新组合,从而相互干扰。这将创建一个对比度与图像成正比的图像差在两个偏振光束之间的光相位,因此命名为“差”干涉显微镜。DICM产生的图像出现与采样光束之间的位移方向相关的三维图像,这导致样品边缘具有亮区或暗区,具体取决于两者之间的光学相位差的符号(如下图8)。
在偏振光显微镜中,样品用偏振光照射,光的检测也对偏振敏感。为了实现这一点,偏振器用于控制照明光偏振并将成像系统检测到的偏振限制为仅一种特定的偏振。通常,照明和检测偏振设置为垂直,以便强烈抑制不与样品相互作用的不需要的背景照明光。这种配置需要一个双折射样品,它引入了照明光偏振角的旋转,以便它可以被成像系统检测到,例如,观察晶体的双折射以及它们的厚度和折射率的变化(如下图9)。
荧光显微镜用于对发出荧光的样品进行成像,也就是说,当用较短波长的光照射时,它们会发出长波长的光。示例包括固有荧光或已用荧光标记物标记的生物样品,以及单分子和其他纳米级荧光团。该技术采用了滤光片的组合,可阻挡短波长照明光,但让较长波长的样品荧光通。
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