基因编辑是一种精确修改基因组序列以诱导基因组插入、删除或碱基替换的技术。许多疾病都伴随着体内基因表达的变化,尤其是一些由单个基因突变引起的遗传疾病,而基因编辑技术有望在基因水平控制疾病的发生。迄今为止,基因编辑技术主要经历了三代的发展:第一代基因编辑技术是锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs);第二代为转录激活因子样效应物核酸酶(tranion activator-like effector nucleases, TALENs);应用最广泛的第三代基因编辑技术是成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas)。与使用靶向DNA链蛋白质的ZFNs和TALENs不同的是,CRISPR技术通过改变向导RNA中一小段片段的碱基序列将Cas蛋白定向到基因组的特定位置,从而提高了基因编辑的效率,也扩大了基因编辑技术的适用性。
虽然有几项实验证明使用基因编辑技术在体外修饰细胞再回输体内可以治疗某些疾病,但这种方法不适用于大多数类型的疾病。在CRISPR技术成为一种常见的治疗模式之前,实现稳定、高效和安全的体内递送是必须克服的挑战。CRISPR系统如质粒DNA(plasmid DNA, pDNA)、mRNA和核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNPs)在直接递送后易在体内降解和免疫清除,因此需要递送载体的帮助。腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)载体因其负载能力有限、缺乏特异性靶向能力以及不能整合到宿主基因组等缺点,因此不适合在大多数疾病中应用。非病毒载体是近年来的研究热点,其中脂质纳米颗粒已在临床上用于递送CRISPR基因药物。在动物实验中,聚合物纳米粒子、仿生纳米材料和外泌体也显示出递送CRISPR系统的潜力。我们需要进一步研究和开发将非病毒载体以便应用于广泛的临床研究。
在这篇综述中,我们讨论了CRISPR技术的发展,并总结了近年来发展的各种类型的基因编辑工具。文中还总结了CRISPR系统在体内的递送系统,重点讨论了开发更适合不同疾病的新系统,最后讨论了应用CRISPR技术治疗疾病可能出现的一系列问题和相应的策略。综上所述,该方法对于为不同疾病提供最有效的基因治疗模式具有积极的意义。
CRISPR相关基因编辑技术是目前最热门的生物工具之一。自2013年以来,CRISPR技术的研究呈爆发式增长,数以万计CRISPR相关的文章被发表。2020年10月,诺贝尔化学奖被授予法国微生物学家艾曼纽埃尔·卡彭蒂耶和美国生物学家珍妮弗·杜德纳,以表彰他们“开发了一种新的基因组编辑方法”。这种方法在受到广泛关注之前已经被科学家研究了近30年(见图1)。
图1 CRISPR/Cas技术发展中的主要事件时间表和代表性Cas9变异体。1987年,CRISPR序列首次被报道。Cas9切割DNA双链的机制在2012年被报道,随后Cas9被用于哺乳动物细胞的基因编辑。此后,CRISPR技术迅速发展,多个具有特定功能的Cas9变异体被鉴定出来。具有代表性的变体是单碱基替换工具(例如CBE和PE)和转录调控工具(例如dCas9)。自2016年以来,基于CRISPR的基因编辑技术陆续应用于临床并取得了巨大成功。CRISPR表示成簇规律间隔短回文重复序列、Cas表示CRISPR相关、dCas9表示死亡Cas9、PAM表示原间隔序列相邻基序、CBE表示胞嘧啶碱基编辑器、ABE表示腺嘌呤碱基编辑器、GBE表示糖基化酶碱基编辑器。(图由Adobe Illustrator创建)
一种特殊的重复间隔的序列。和许多伟大的发现一样,CRISPR技术的发现也是在一个意想不到的事件中诞生的。1987年,Nakata等人在研究大肠杆菌的iap基因时首次报道了一个位于iap基因3端结构域的不寻常序列。该序列由5个高度同源的序列组成,包含29个核苷酸,间隔为32个核苷酸。
在接下来的十年里,这种特殊的重复序列在多种细菌和古细菌中被检测到。2002年,Janson等人对已确定的特定重复序列进行了概括总结,将这些重复序列命名为一个家族,并使用缩写CRISPR表示成簇规律间隔短回文重复序列。此外,之前的研究已经揭示了多种CRISPR相关蛋白(Cas)—Cas1~Cas4。
细菌和古细菌的防御武器。2005年,研究人员发现CRISPR中的间隔序列并非每种生物所特有。Mojica等发现,大多数间隔序列来源于外源性DNA,只有一小部分与外界无关,并且他们发现病毒更有可能感染没有同源间隔序列的细胞。他们推测CRISPR与细菌抵抗外部噬菌体感染和质粒转移有关。这一猜想在两年后得到证实。
当首次遭遇噬菌体或质粒侵袭时,含有CRISPR序列的细菌会获得他们的一段DNA序列,这段序列作为特殊重复序列之间的间隔区域。CRISPR RNA(crRNA)经过一系列的转录和成熟过程,产生一个含有20个碱基的原间隔序列的单链crRNA,该单链crRNA通过互补碱基配对与入侵的DNA结合。仅由crRNA识别外源序列并不能保护其免受噬菌体的攻击,还必须通过Cas蛋白的裂解活性干扰外源序列而使其失活。
CRISPR/Cas蛋白家族根据基因组和蛋白质结构信息分为两类,其中最著名的蛋白Cas9属于第二类CRISPR/Cas系统。第一类CRISPR/Cas系统的特征是一个能够剪切DNA链的大型Cas9蛋白复合物,而第二类只需要一个剪切蛋白。Cas9的特征是存在两个核糖核酸酶结构域,靠近氨基端的RuvC样核酸酶结构域和位于蛋白质中间的HNH核酸酶结构域,这两个结构域都具有切割DNA链的功能。值得注意的是,原间隔序列并非从外源序列中随机获得,而总是伴有一种富含鸟嘌呤的序列(该序列被称为原间隔相邻基序(PAMs))。随后的研究表明,PAM序列在获取间隔区(在该区域Cas蛋白进行切割)中发挥重要作用。
随着CRISPR/Cas9的功能机制逐步被揭示,天然CRISPR/Cas9已迅速应用于细菌转化。在2011年Siksnys等人将第一个CRISPR基因序列从嗜热链球菌转移到大肠杆菌中,并且接受了CRISPR基因序列的大肠杆菌成功抵御了质粒转化,这是关于CRISPR/Cas9在非宿主细菌中发挥作用的首次报道。这一发现提示,CRISPR/Cas系统可作为抵御外部感染的防御机制,而且CRISPR系统发挥作用并不依赖CRISPR/Cas系统的宿主。
在2012年Charpentier和Doudna从嗜热链球菌和化脓性链球菌中纯化了Cas9蛋白,使原核DNA能够在体外裂解。他们还阐明了CRISPR/Cas9的工作机制,指出Cas9的裂解位点由crRNA中的种子序列控制,并且需要PAM的参与。此外,通过改变种子序列的核苷酸序列,该系统可以在多种情况下发挥基因沉默的作用并通过改变核苷酸种子序列提供基因靶向和基因编辑的功能。
哺乳动物细胞的基因编辑。之前关于CRISPR/Cas9的研究主要集中在原核细胞,在2013年张峰等人发表的一篇论文开始将CRISPR技术应用于医学、农业等领域。他们将反式激活crRNA(tracrRNA)、pre-crRNA、宿主因子核糖核酸酶(RNase) III和来自化脓性链球菌的Cas9整合到人源293T细胞中,并添加各自的启动子和两个核定位信号(nuclear localization signals, NLSs)以确保该结构顺利进入细胞核。该实验针对位于人空气门同源盒1(EMX1)位点的PAM前的30个碱基对。结果表明在至少spCas9、tracrRNA和pre-crRNA存在的条件下实现了EMX1切割。另外,来自嗜热链球菌的Cas9的功能也被张峰等人验证并得到了一致的结果。
在同年发表的另一篇论文中,Church等构建了crRNA-tracrRNA融合转录体成为sgRNAs并将crRNA缩窄至20bp。这些研究具有重大意义,既证实了CRISPR基序在哺乳动物细胞中起作用,又简化了CRISPR基因编辑系统,从而为CRISPR的使用提供了更多可能性。
转录调控工具 dCas9。Cas9的DNA链切割功能是通过设计一个简单的sgRNA片段来引导Cas9到达目标位点来实现的,但许多关于基因的其他研究已被用于研究DNA链切割以外的功能。Qi等人突变了上述野生型Cas9的RuvC1和HNH核酸酶结构域(D10A和H841A),导致Cas9失去裂解酶活性。针对非模板DNA链设计的sgRNA能有效沉默dCas9基因的表达,而针对模板DNA链设计的sgRNA不能有效沉默基因的表达。sgRNA与靶基因启动子序列的相对位置对沉默效率也有显著影响。重要的是,无论靶序列是模板链还是非模板链,对于靶向启动子序列的sgRNA基因沉默都会发生。2013年7月,Qi等人的另一项研究发现,dCas9与VP64、KRAB等转录调控相关的效应蛋白相互作用共同调控基因表达,这是目前dCas9最常用的用途。
首次研究利用 CRISPR技术治疗疾病。在CRISPR/Cas9被证明在哺乳动物细胞中发挥作用后的几个月里,科学家迅速在小鼠、果蝇和大鼠等动物以及水稻和小麦等植物中实现了基因编辑。然而,治疗疾病是对CRISPR技术的最大期望。在2013年12月,Wu等人发表了一项利用CRISPR/Cas9在碱基缺失导致白内障的小鼠模型中治疗白内障的研究。他们将编码Cas9的mRNA和sgRNA共同注射到将患白内障的小鼠的受精卵中。在获得的22只幼鼠中,10只携带突变等位基因,其中6只NHEJ介导的插入和缺失以及4只HDR介导的修复。HDR诱导的4只小鼠白内障均治愈,其中2只NHEJ诱导的小鼠成功治愈。基于这些结果,CRISPR/Cas9可以修饰基因组来治疗遗传性疾病。在同一时期进行的另一项研究中,Schwank等人从有囊性纤维化跨膜导体受体(CFTR)突变的2例患者分离出了肠道干细胞,并使用CRISPR/Cas9技术纠正了致病突变。此外,他们提出了对基因突变干细胞进行体外编辑并随后将其引入体内治疗疾病的方案,该方案在几年后成功用于临床。
单碱基基因编辑技术。虽然CRISPR/Cas9通过切割双链进行再修复成功治愈了一些点突变引起的疾病,但该方法的低效和不确定性限制了其应用。2016年,Komor等人认为遗传性疾病的治疗应纠正突变的碱基,而不是将其切除以允许其随机重组。胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱酰胺转化为尿嘧啶,尿嘧啶随后通过复制转化回胸腺嘧啶。因此,他们将CRISPR/dCas9与鼠源胞苷脱氨酶(APOBEC1)整合,成功实现了C→U碱基转换。这一碱基编辑技术也经过改进以提高碱基替换的效率和精度。单碱基基因编辑技术的发明不仅提供了一种可预测的碱基替换方法,也设计了一种碱基替换框架便于后续发明更多的碱基替换方法,而这对于治疗碱基突变导致的遗传病具有重要意义。
RNA编辑工具Cas13a。CRISPR/Cas13a(以前称为C2c2)是从沙希纤毛菌(Leptotrichia shahii)中提取的第二类VI型CRISPR/Cas家族蛋白。其特征是包含两个高级真核和原核核苷酸结合(HEPN)结构域,该结构域可高效降解几乎所有单链RNA,而Cas13a对靶标RNA的识别是由sgRNA介导的。之前发现的Cas相关蛋白作用于DNA链,而Cas13a的发现为识别和检测RNA病毒(如SARS-CoV-2)提供了一种新方法。Cas13a还被证实以类似于RNAi的方式降低基因表达效。
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