对于临床医生来说,修复骨缺损仍然具有挑战性。在骨组织工程中,具有再生潜力的骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)被认为是骨再生的理想细胞来源,因为它们在治疗骨质流失和成骨不全方面显示出希望。但其局限性在于中BMSCs的比例相当低,而治疗需要大量的BMSCs。
研究表明,BMSCs的发育可以通过以下因素决定:外源性可溶性生长因子、细胞因子、激素和化学物质以及外部机械调节。浓缩生长因子(CGF)是继富血小板血浆和富血小板纤维蛋白之后的第三代富血小板衍生物,它含有纤维蛋白和多种生长因子,如血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β1。这些成分使CGF具有出色的组织修复和再生能力。
确定BMSCs发育的另一种方法是依靠与其他成熟细胞群的共培养。内皮细胞用于促进血管生成,当它们与BMSCs直接接触时,可以通过表达各种因子在体外成功诱导成骨分化。因此,研究共培养的人BMSCs(hBMSCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)对于评估内成骨与血管生成的相关性具有重要意义,对于探索hBMSCs在骨再生中的应用具有重要意义。
福建医科大学附属第一医院口腔科、福建医科大学面部整复与重建研究室以及奥地利维也纳医科大学牙科学院的一项联合研究采用hBMSCs和HUVECs的直接和间接共培养系统,研究CGF对hBMSC成骨分化的影响。分析直接和间接共培养下成骨表达的差异及其机制,对促进临床骨再生和骨愈合具有重要的实用价值。
hBMSC增殖随时间呈CGF浓度依赖性变化,但HUVEC增殖不明显。第4天,5%、10%和20% CGF组的hBMSCs数量显著高于共培养对照组。当CGF含量10%时,hBMSCs的数量随着CGF浓度的升高而增加,但20% CGF条件下hBMSCs的增殖水平低于10% CGF。第7天,只有20% CGF组的hBMSCs数量显著高于共培养对照组,并且hBMSCs的数量随着CGF浓度的增加而增加。关于HUVECs,第1天和第4天的数量没有明显变化。在第7天,5%和10% CGF组的细胞数量明显高于共培养对照组。当CGF浓度为5%时,HUVECs的数量随着CGF浓度的增加而增加(图1 A)。
在CGF处理的第1天,5%、10%和20% CGF组的hBMSCs百分比明显低于共培养对照组。然而在第4天,10%和20% CGF组中hBMSCs的百分比显著高于共培养对照组,10% CGF组中hBMSCs的百分比在所有组中最高。在第7天,hBMSCs的百分比分别在5%和20% CGF组中最低和最高(图1 B)。
图1在不同浓度的CGF下,第1天、第4天和第7天以1:2的比例直接共培养的hBMSC和HUVEC数量
为了研究不同浓度CGF对直接培养的hBMSCs成骨分化能力的早期影响,进行了ALP染色和ALP活性的定性和定量分析。染色结果显示,与未处理的hBMSCs相比,用CGF处理的每组的染色增加。值得注意的是,当CGF浓度为10%时,颜色随着CGF浓度的增加而加深。然而,在20%的CGF下,染色变浅。定量分析表明,当CGF浓度为10%时,ALP活性增加。
为了比较不同CGF浓度下的相关基因表达水平,在2%、5%、10%和20% CGF处理7天后,使用qRT-PCR测量了成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、人I型胶原蛋白(COL-1)、Runt相关转录因子2(Runx2)和间隙连接蛋白43(CX43)。在10% CGF组中,ALP、Col-1、Runx2、OCN和CX43的表达水平均高于共培养对照组。此外,10% CGF对ALP、RUNX2、OCN和CX43表达的促进作用高于所有其他组,仅对COL-1基因表达的影响次于20% CGF。总体而言,10% CGF最有效地促进了直接共培养的hBMSCs的成骨分化以及hBMSCs和HUVECs之间的交联。此外,共培养组中ALP、COL-1和OCN的表达水平高于仅单独培养的hBMSCs组。与共培养对照组相比,COL-1和OCN在20% CGF下也表现出明显的增加。
CX43在直接共培养的hBMSCs和HUVECs中的第7天进行免疫荧光染色,观察到明亮的点状染色为连接hBMSCs和HUVECs的橙色点(图2)。结果表明,hBMSCs和HUVECs之间形成了间隙连接。
CX43(橙色)标记连接蛋白,CD31(绿色)标记HUVECS,DAPI(蓝色)显示细胞核。白色箭头表示hBMSC和HUVEC之间的CX43表达。
处理7天后,直接共培养组和对照组ALP表达均高于间接培养组(图3)。尽管差异不显著,但OPG、OCN和CX43的表达表现出相同的趋势。直接共培养组和对照组的增加比间接共培养组和对照组更明显。这表明,无论是否存在CGF,直接共培养组在促进共培养细胞的成骨分化方面比间接共培养组更有效。这些结果表明,hBMSCs和HUVECs之间的细胞通讯在促进共培养细胞的成骨分化中发挥了重要作用。
此外,与没有CGF的对照组相比,10% CGF增强了直接和间接共培养组中ALP、OPG、OCN和CX43的表达。此外,在CGF为10%的直接共培养组中,ALP、OPG、OCN和CX43的表达量最高,表明CGF可以促进共培养细胞的成骨分化。这也可以通过增加细胞间通讯作为一种调节机制来增强。
图3在10% CGF下,hBMSCs成骨相关基因在与HUVECs直接和间接共培养中的相对表达
为了探究CGF直接共培养hBMSCs促成骨分化的机制,进行了高通量RNA-seq转录组分析。结果显示,与0% CGF组相比,10% CGF组有605个DEGs上调,286个DEGs下调(图4 A)。KEGG通路分析表明,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)信号通路可能在CGF对共培养hBMSCs成骨的影响中发挥重要作用(图4 B)。通过qRT-PCR验证了与mTOR信号传导相关的上调基因。与不含CGF的对照组相比,用10% CGF孵育可增强直接共培养组中MAP2K1、ULK1和PIK3CA的表达(图4 C)。
(A)直接共培养的hBMSCs中10% CGF与对照组差异表达基因(DEGs)的火山图。(B)代表性上调的KEGG通路类别。(C)MAP2K1、ULK1、PIK3CA的mRNA表达水平。
总之,该研究表明,10% CGF对直接与HUVECs共培养的hBMSCs发挥显著的成骨作用,mTOR/ULK1通路激活的自噬和CX43介导的细胞间通讯可能在促进hBMSCs成骨分化中发挥调节作用。
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