炎症性肠病(IBD)的发病率在中国一直呈上升趋势,预计到2025年将达到约150万例,但其病因机制尚不清楚,现有治疗方法的疗效仍然有限。目前,主流的治疗策略包括药物干预和外科手术,主要的药物制剂包括5-氨基水杨酸酯(5-ASA)和柳氮磺胺吡啶(SASP),遗憾的是,它们可能会产生不良反应或造成经济负担。因此,追求低成本、高效、低毒的药物制剂或功能性食品已成为一种发展趋势。上海中医药大学中药研究所王辉俊团队研究了蒸制多花黄精多糖(PSP)的结构特征,深入分析了其潜在的抗炎机制,特别关注其对肠道微生物群的影响。结果表明,PSP对结肠炎具有很好的缓解和治疗作用,从而为PSP在预防和治疗结肠炎的功能食品的开发利用奠定了基础。
炎症性肠病(IBD),包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),主要是由不健康的生活习惯引起的,如富含糖和脂肪的饮食、不规律的工作时间表、有限的身体活动和工作压力[1,2]。在这些因素中,IBD以腹痛、腹泻和便血等症状为特征,是一种以胃肠道病变为特征的慢性复杂炎症[3]。流行病学调查显示,IBD的患病率为每10万人6-25例,其中西方国家发病率特别高,为每10万人20例,中国发病率相对较低,为每10万人2例。值得注意的是,IBD的发病率在中国一直呈上升趋势,预计到2025年将达到约150万例[4]。鉴于这些趋势,全面探索IBD的发病机制和治疗仍然是至关重要和紧迫的。然而,IBD病因机制尚不清楚,现有治疗方法的疗效仍然有限。目前,主流的治疗策略包括药物干预和外科手术,主要的药物制剂包括5-氨基水杨酸酯(5-ASA)和柳氮磺胺吡啶(SASP),遗憾的是,它们可能会产生不良反应或造成经济负担。因此,追求低成本、高效、低毒的药物制剂或功能性食品已成为药物研究和疾病管理的新前沿。
近几十年来的临床研究表明,天然多糖对IBD具有有效的保护和缓解作用。天然多糖可以通过调节肠道菌群的结构和组成,恢复肠黏膜屏障和免疫系统来缓解IBD症状[5]。例如,与黄芪相比,蜂蜜黄芪在保护肠道黏膜、调节细胞表达因子、影响微生物多样性等方面具有更好的抗炎作用[6];黄芪多糖不仅能改善结肠病理损伤,降低髓过氧化物酶(MPO)活性,还能抑制促炎细胞因子水平[7]。多花黄精(Polygonatum cyrtonema, PC)是黄精科黄精属黄精的根茎,是一种药食两用的中药,具有补气滋阴、健脾、润肺益肾的功效[8]。根据中医基础理论,临床上使用的中药经多次蒸煮可增强药效,其主要活性成分之一是多糖。现代药理学研究表明,多花黄精多糖(Polygonatum cyrtonema polysaccharides, PCP)具有免疫调节、抗炎、降血糖、心血管保护、抗肿瘤和抗氧化活性[9,10]。然而,关于蒸制多花黄精多糖(PSP)药理作用的研究几乎没有报道,其具体的药理特性尚不清楚。虽然有研究表明PC寡糖对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎有治疗作用,但作为蒸制多花黄精(PS)的主要成分PSP的抗炎潜力尚未报道。因此,本文研究了PSP对结肠炎的缓解作用及其机制。
本文首次采用光谱与色谱相结合的方法研究了PSP的结构特征。随后,在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中探讨PSP的保护和缓解作用。此外,深入分析了其潜在的抗炎机制,特别关注其对肠道微生物群的影响,并进行了讨论。值得注意的是,这项研究首次对PSP的结构特征进行了彻底的研究,并对其抗炎潜力进行了实验验证。研究结果强调了多糖对结肠炎的缓解和治疗作用,从而为PSP在预防和治疗结肠炎的功能食品的开发利用奠定了基础。
图1c为PSP-W-1的红外光谱。3300和2890 cm−1的吸收带是多糖的典型吸收带,分别与多糖分子中的O-H拉伸振动和C-H拉伸振动有关。1635 cm−1处的吸收峰归因于O-H弯曲振动。1035 cm−1处的强吸收峰归因于C-O-H或C-O- C引起的C-O弯曲振动,表明吡喃糖环的存在。此外,889 cm−1处的吸收峰表明存在β-糖苷键,这在先前的研究结果中得到了证实。
气相光谱分析(图2a, b)显示存在一个单峰,通过与标准单糖的比较确定为半乳糖。结果表明PSP-W-1由半乳糖组成,进一步表明PSP-W-1是一种半乳聚糖。同时,该团队用间羟基联苯法对该半乳糖进行了检测,发现它基本上是一种不含半乳糖醛酸的中性多糖。
PSP-W-1经酸水解成单糖,在酸性条件下与异丙醇胺反应生成含C—N双键的亚胺,亚胺经氰硼氢化钠还原成乙胺,再与乙酸酐反应生成乙酰化产物,通过GC-MS分析检测。通过与相应D/L构型的单糖衍生物的峰比较,可以确定多糖中单糖的绝对构型。图中为PSP-W-1与不同构型半乳糖标准品的GC色谱图,通过与标准品的对比可以判断PSP-W-1的D构型(图2c、d、e、f)。
图2 单糖成分分析的气相色谱图。(a) 单糖标准品。(b) PSP-W-1。(1.鼠李糖;2.岩藻糖;3.阿拉伯糖;4.木糖;5.甘露糖;6.葡萄糖;7.半乳糖;8. L-手性肌醇)。绝对构象分析的气相色谱图。(c) D-半乳糖标准品。(d) L-半乳糖标准品。(e) 绝对配置标准。(f) PSP-W-1。(1. D-半乳糖;2. L-半乳糖)。
为了确定PSP-W-1的糖苷键的连接,将其甲基化三次得到完全甲基化的多糖,并研究了PSP-W-1部分甲基化的醋酸糖醇(PMAA)的总离子色谱(TIC)(图3a)。GC-MS分析表明,PSP-W-1衍生物含有三个相应的PSP-W-1糖苷键,相应的摩尔比如表3所示。参考文献资料,对于PSP-W-1 TIC谱图中的三个峰被鉴定为1,5-二-O-乙酰基-(1-二乙基)-2,3,4,6-四-O-甲基半乳糖醇(图3b),1,4,5-三O-乙酰基-(1-三乙基)-2,3,6-三-O-甲基半乳糖醇(图3c)和1,4,5,6-四乙酰基-(1-二丁基)-2,3-二-O-甲基半乳糖醇(图3d)。PSP-W-1的主链由1,4-连接的Galp和1,4,6-连接的Galp构成,其主要分支点位于1,4,6-Galp的C-6,这些结构被核磁共振分析证实并进一步详细。
从图4a可以看出,多糖C-1上的质子信号通常分布在4.0-5.5 ppm,比较容易分辨,而C2-C6上的质子信号大多在3.0-4.0 ppm堆积,相互交叉重叠,比较难分辨。因此,图4a主要用于区分多糖结构中糖苷键的构象,进一步证实图4b的分析结果。总的来说,α-糖苷键构象的化学位移值5 ppm,β-糖苷键构象的化学位移值5 ppm。从图中初步判断,PSP-W-1中存在β-糖苷键构象。
基于这些结果,PSP-W-1具有1,4-连接的β-D-Galp重复单元的主干,并且在半乳糖的C-6部分被T-连接的β-D-Galp连接的分支所取代。同样,这与甲基化分析的结果一致。因此,推导出PSP-W-1可能的结构如图4f所示。
该团队进一步在体内测定了PSP-W-1对DSS诱导结肠炎的影响(实验设计如图5a所示)。DSS诱导小鼠出现与IBD相似的血便、体重减轻、腹泻等临床表现。此外,DSS处理后的炎症和免疫抑制导致小鼠脾肿大和短暂性胸腺萎缩。收集小鼠结肠、脾脏和胸腺作为结肠炎的典型指标计算脏器指数。毫无疑问,与对照组相比,DSS处理后显著增加了小鼠DAI水平(从第4天开始),降低了体重(从第3天开始),增加了脾脏指数,降低了胸腺指数。然而,与DSS组相比,口服L-PSP-W-1、M-PSP-W-1、H-PSP-W-1和SASP可恢复体重(图5b),降低DAI水平(图5c),降低脾脏指数(图5e)和增加胸腺指数(图5g)。结肠和脾脏形态如图5f所示。实验第6-7天,5个治疗组结肠炎小鼠体重均无明显下降,粪便中的血几乎消失。此外,尽管五个治疗组能够抵抗结肠炎诱导的胸腺抑制,但差异无统计学意义。
通过观察和研究各组结直肠病理切片(HE染色)的结果发现,这与以往的药效学研究结果一致。对照组小鼠结肠壁完整连续,肠上皮细胞清晰可见,腺体结构正常排列整齐,杯状细胞丰富,未见急性炎性细胞浸润;DSS组小鼠肠壁明显增厚,组织结构被扰乱,杯状细胞缺失,隐窝破坏消失,中性粒细胞和炎症细胞浸润到粘膜和粘膜下层,见图5i(组织评分见图5h)。然而,与DSS组相。
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