仙连解毒方(XLJDD)因其显著的疗效被用于治疗结直肠癌(CRC)。尽管XLJDD具有明显的临床疗效,但其抗CRC的作用机制仍不清楚。本研究揭示XLJDD对偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸钠(AOM/DSS)诱导的小鼠CRC的抑制作用及其机制;采用AOM/DSS诱导的小鼠模型,评价不同剂量XLJDD给药后的疗效;通过组织病理学、免疫荧光和ELISA分析方法,研究XLJDD对AOM/DSS诱导的CRC的治疗作用;此外,还使用代谢组学图谱和16S rRNA分析来探索XLJDD治疗CRC的有效机制。结果显示,XLJDD降低了结肠内壁肿瘤生长数量和结肠重/长比,抑制了疾病活动指数(DAI)评分,同时增加了体重、结肠长度和总生存率。XLJDD降低血清中炎性细胞因子水平和降低结直肠组织中β-连环蛋白、COX-2和iNOS蛋白表达水平的能力,表明XLJDD具有抗炎特性,可以缓解炎症相关疾病。从机制上讲,XLJDD改善了肠道微生物群失调和相关的短链脂肪酸(SCFAs)、鞘脂和磷脂代谢水平。这是通过降低Turicibacter、Clostridium_sensus_stricto_1的丰度以及鞘氨醇、LPCs和PC的水平来实现的。此外,XLJDD增加了Enterorhabdus和Alistipes益生菌的丰度,以及丁酸和异戊酸的含量。本文提供的数据表明,XLJDD可以通过降低炎症水平、缓解肠道微生物菌群失衡和代谢紊乱,有效抑制结肠内壁肿瘤的发生。为CRC的临床防治提供了科学依据。
我们通过UPLC-QTOF/MS分析鉴定了XLJDD的17个成分,主要含有生物碱、有机酸和黄酮类化合物(补充表S1;图1A、B)。我们定量分析了四种成分,包括苦参碱(3.02 mg·g−1)、氧化苦参碱(1.90 mg·g–1)、黄连碱(0.53 mg·g-1)和黄连素(1.09 mg·g-1)(表3;图1C、D)。
图1 UPLC-Q/TOF-MS分析的总离子流图(A-正离子模式,B-负离子模式)和UPLC-TQ/MS分析的总电离流色谱图(C-混合对照溶液,D-XLJDD样品溶液)。
如实验方案所示(图2A),我们在AOM/DSS模型中检查了两种不同剂量的XLJDD(11和44 g/kg/d)和奥沙利铂对结直肠组织学和肿瘤相关表型的影响。结果显示,阳性药物奥沙利铂对体重增加有负面影响,而XLJDD可以有效缓解模型中的腹泻、直肠脱垂和体重减轻(图2B-C)。存活曲线还显示,XLJDD处理提高了实验期间AOM/DSS处理的小鼠的存活率。奥沙利铂组的存活率在第一阶段显著降低(图2G)。结肠内壁上肿瘤生长的数量、结肠的长度以及结肠的质量与长度的比率是评估CRC严重程度的直观指标。在对动物实施安乐死之后,我们发现与模型组相比,XLJDD组和奥沙利铂组的结肠直肠肿瘤负荷和数量显著减少,结肠长度和结肠重/长比增加(图2D-F)。总之,这些结果表明,XLJDD在AOM/DSS诱导的CRC模型中的显著抗肿瘤作用是以剂量依赖的方式产生的。
图2 XLJDD在AOM/DSS模型中显著抑制肿瘤的发生和发展。(A)动物实验设计。(B)每3天记录一次小鼠疾病活动指数(DAI)评分的变化。(C)每周记录小鼠体重的变化。(D)133天后测量息肉数量、(E)结肠长度和(F)结肠重量/长度。(G)五个不同组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。(A-G)n = 每组8-15只小鼠,平均值±SD,p值通过单因素方差分析进行分析。n = 8-15,与对照组相比,###p<0.001;与模型组相比,*p<0.05,**p0.01,***p<0.001。
结肠直肠物理图像如图3A所示。H&E染色显示AOM/DSS可引起严重的肠道炎症。在结直肠切片中,我们观察到上皮发育不良和细胞核,XLJDD和奥沙利铂可显著减少细胞核和炎症细胞浸润(图3A-C)。先前的研究表明,β-连环蛋白是检测结直肠癌前病变的指标。XLJDD可以降低结直肠组织中β-连环蛋白阳性细胞的比例(图3B,C)。此外,炎症的存在与iNOS和COX-2的上调有关,从而增加癌症的风险。在本研究中,模型组iNOS和COX-2的表达水平增加,而XLJDD和奥沙利铂处理后显著减少了这种增加(图3B、C)。促炎细胞因子分析还显示,处理后小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的水平在一定程度上降低(图3D)。总之,XLJDD可以有效抑制肿瘤相关炎症和CRC的发展。
图3 XLJDD可减少组织损伤、肠道炎症和肿瘤发展。(A)小鼠结肠的大体病理学和组织学图像。核(红色箭头)、隐窝脓肿(箭头)、腺腔扩张(灰色箭头)、炎症细胞浸润到黏膜下层(蓝色箭头)和肠道增生(绿色箭头)。(B)结肠组织的免疫荧光(比例尺:50μm,n=3)。(C)组织病理学评分和结肠组织中β-连环蛋白、COX-2、iNOS阳性细胞的百分比,n=3。(D)小鼠血清中炎症因子的含量,n=8。(A-D)数据表示为平均值±SD,与对照组相比,##p<0.001,###p<0.001;与模型组相比ns p>0.05,*p<0.05;**p<0.01,***p<0.001。
我们通过GC-FID测定AOM/DSS诱导的小鼠结肠内容物中六种SCFA的含量(补充表S2;补充图S1)。与对照组相比,AOM/DSS显著降低了结肠内容物中丙酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的浓度(p0.01)。XLJDD处理后,CRC小鼠结肠中丙酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的含量显著增加(p0.05)。XLJDD具有增加乙酸和丁酸含量的趋势(p0.05)。奥沙利铂处理后,小鼠短链脂肪酸含量没有显著增加(p0.05)。特别是低剂量XLJDD有利于丙酸和异丁酸的释放,而高剂量XLJDD更有利于异戊酸和戊酸的释放(图4)。
图4 短链脂肪酸(SCFAs)对小鼠结肠内容物产生的影响。(A)乙酸。(B)丙酸。(C)异丁酸。(D)丁酸。(E) 异戊酸。(F)缬草酸。(A-F)数据表示为平均值±标准差,n=8。与对照组相比,ns p>0.05,##p<0.001;### p<0.001。与模型组相比,ns p>0.05;*p<0.05;***p<0.001。
为了确定XLJDD对肠道菌群的调节作用,我们首先进行了alpha多样性分析。物种丰富度指数显示,模型组的Sobs、Ace和Chao指数显著低于对照组(p0.05)(图5A-D)。接下来,我们进行了beta多样性分析,以探索不同组之间群落组成的相似性和差异性。PCA和PCoA分析结果显示,空白组与模型组距离较远,物种组成差异较大,表明AOM/DSS诱导的CRC疾病状态下小鼠的粪便菌群发生了显著变化。给药后在一定程度上偏离模型组,接近正常组,表明XLJDD和奥沙利铂在一定程度上改善了CRC小鼠的粪便菌群多样性(图5E,F)。
图5 XLJDD调节AOM/DSS小鼠肠道微生物丰富度和多样性。(A)Ace指数。(B)Chao指数。(C)Sobs指数。(D)Shannon指数。(E)主成分分析(PCA)分析。(F)主坐标分析(PcoA)分析。(A-F)数据表示为平均值±标准差,n=8。与对照组相比,#p<0.05,## p<0.01。
我们分析了各类群在门和属水平上的分类组成。直方图显。
18新利官网