斑马鱼在脑血管疾病方面的研究优势,脑血管疾病研究领域中斑马鱼相对传统的模式生物而言,有其独特的优势,体现在多个方面:
(1)斑马鱼体型虽小,但产卵量大、生长周期短,养殖并不繁琐且费用低廉,是一种可提高实验效率的脊椎模式生物。与许多哺乳动物的受精方式不同,斑马鱼胚胎及幼鱼身体透明,利用转基因斑马鱼,例如在内皮中表达绿色荧光蛋白的tg(flk1:gfp)斑马鱼可以便捷地用荧光显微镜观察到全身血管。
(2)在脑血管生成和血脑屏障结构方面,斑马鱼与哺乳动物具有极高的相似性。不仅在脑血管的发育和功能上与哺乳动物具有高度一致性,而且在促进血管生成的细胞和分子机制上具有高度的保守性。同时,斑马鱼的免疫系统与哺乳动物相似,包括具备相对完整的适应性免疫系统和保守的先天性免疫系统。
(3)斑马鱼胚胎及幼鱼能够进行成像,允许实时可视化血管生成的观察,并可以在空间和时间上判断斑马鱼血流动力学和血管结构的变化,使得斑马鱼在脑血管疾病研究中的地位愈发重要。
(4)斑马鱼的全基因组测序工作已完成,其遗传序列与人类遗传序列高度保守。同时针对斑马鱼的基因操作技术已非常成熟,通过靶向修饰或敲除某些基因改变其表达水平,可以较容易地对兴趣基因进行精确操作,非常适合进行人类疾病建模及机制研究。
斑马鱼是一个单一的循环回路: 心-鳃-身体-心。有研究斑马鱼放入一个缺氧室里,里面装有氧浓度很低的水( < 0.8 mg/mL) 来模拟一个缺血缺氧性脑损伤模型。缺氧一定时间后鱼会沉到容器底部,然后将其转移到正常培养环境让其复氧。缺氧处理后的斑马鱼会有行为学上的改变如抽搐、不平衡游动等,缺氧性脑损伤后的斑马鱼脑组织用TTC染色观察脑组织损伤的分布,发现缺血缺氧后10 min的斑马鱼脑组织视神经叶顶盖处会出现缺血半暗区,并且随着缺氧时间的延长梗死灶的范围会扩大。此研究构建了一个相当于缺血性脑卒中造成的缺血缺氧性脑损伤的斑马鱼模型,对于研究脑卒中复杂的细胞分子病理生理改变和临床上开发神经保护药物有着重要意义。
斑马鱼被认为是研究动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)机制和治疗靶点的极好的模式生物,在AS研究中显示出了无法比拟的优势:首先,斑马鱼的脂蛋白生物学和代谢特点与人类基本相同;其次,斑马鱼通过喂饲高胆固醇饮食很容易诱发与人类相似的以低密度脂蛋白水平增高为主的高胆固醇血症,而不同于啮齿动物高密度脂蛋白水平升高为主的模式;再次,短时间暴露于高胆固醇饮食后,斑马鱼幼鱼即可出现低密度脂蛋白的氧化、巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的吞噬、脂质在血管壁的沉积以及向内膜下浸润及血管壁脂质条纹的形成,这和人类AS早期的病理变化相同;最后,由于斑马鱼幼鱼鱼体透明,可在共聚焦显微镜下实时成像追踪氧化低密度脂蛋白颗粒,动态观察动脉内AS的整个发生发展过程,具有其他动物模型无法比拟的优越性。
由于只需要传统的倒置光学显微镜就可以方便而直接地观察颅内出血,因此斑马鱼已被广泛地应用于出血性卒中的研究中。例如,Donnini等发现β淀粉样蛋白可诱导斑马鱼内皮细胞老化、微血管形态和功能渐进性改变,提出这可能是散发性或遗传性脑淀粉样血管病的潜在发病机制之一。Sung等发现斑马鱼的alk1基因敲除会造成颅内大动脉异常扩张并与静脉直接相连,这与alk1基因突变患者的脑内动静脉畸形血管表型相似。目前已经确定了脑海绵状血管瘤三个致病基因(CCM1、CCM2和CCM3)的斑马鱼同源基因,研究者通过基因编辑技术或吗啉寡聚核苷酸技术对斑马鱼同源基因进行敲除,观察到斑马鱼形成易于出血的薄壁扩张血管,这与人类脑海绵状血管瘤病理改变相似,可作为人类脑海绵状血管瘤的动物模型并用以探讨该病的发病机制。斑马鱼还被用于颅内动脉瘤形成有关的基因研究,通过全外显子测序发现的thsd1基因可能与颅内动脉瘤发生发展有关,进而在thsd1基因敲除斑马鱼上观察到颅内出血。在机制研究方面,内皮连接稳定性和血管系统完整性的破坏被认为是出血性卒中的重要发病机制之一,而斑马鱼在研究血管完整性方面具备一定的优越性,因此,有越来越多的学者应用斑马鱼进行这方面的研究。
成年斑马鱼在每次交配中可以产生多达300个胚胎,研究者一次可以对数千个有机体进行实验。由于斑马鱼胚胎的直径远小于1mm,因此可以在96或384孔板上进行实验。大多数小分子很容易渗透到斑马鱼体内,只需将药物稀释到鱼水中即可有效地“治疗”生物体。而斑马鱼最大的特点在于胚胎透明,可从观察到所有血管结构,从而可以在显微镜下多角度地观察到血管的发生发展和动力学过程,是一种理想的血管研究动物模型。斑马鱼的微观尺寸、高繁殖力和易给药性,加上易于识别血管表型,使其已成为常用的高通量脑血管药物筛选工具,并逐渐拓展至新药开发及药理学领域。随着斑马鱼高分辨在体成像技术、自动化分选技术及定量化数据分析技术的发展,未来斑马鱼在脑血管药物研究方面将具有更为广阔的应用前景,并将为开发出安全、有效的药物做出巨大贡献。
1、莫东灿,刘柳余,李肖玲,等.模式生物斑马鱼在卒中研究中的应用[J].中国卒中杂志,2022,17(05):548-552.
4、黄春念,张晶晶.模式动物斑马鱼在中枢神经系统疾病研究中的应用[J].中国实验动物学报,2018,26(03):392-397.
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