封闭:PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min。
一抗:水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(GFAP 1:100)并放入湿盒,4℃孵育过夜;
加荧光二抗:PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;
2、二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
3、整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
4、要单独冲洗,防止交叉反应造成污染;要温柔冲洗,防止切片的脱落;冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。
7、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可,之后片子可保留更长时间。
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