胶体金(colloidal-gold)是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层负离子( AuCI2- ),外层离子层H+则分散在胶体间溶液中,以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。见图1.1。
:胶体金颗粒一般大小1~100nm,纳米金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中,形成胶体金溶液。胶体金颗粒有胶体特性,对电解质高度敏感,电解质可以破坏胶体金的稳定状态,使其形成沉淀。
)在510-550nm范围内,随着颗粒大小不同,这一波长也有变化,大颗粒的吸收峰的波长偏于长波长,小颗粒的吸收峰的波长偏于短波长。
层析系统都由两个相组成:一是固定相,另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时,由于各组分的理化性质存在差异,与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同,在两相中的分配(含量比)不同,且随流动相向前移动,各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液,可得到样品中所含的各单一组分,从而达到将各组分分离的目的【1】。
胶体金试纸条的组成主要由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜(NC 膜)、吸水滤纸和 PVC底板 5 部分组成。胶体金试纸条根据其功用可分为 3 个区域,分别为加样区、反应区和吸附区。加样区主要是由样品垫和胶体金垫组成,通过层析作用实现样品与胶体金颗粒之间的结合;反应区即 NC 膜部分,包含检测线和质控线,检测线主要检测样品中是否包含待测物质,质控线则为了确保检测的有效性;吸附区即为吸水滤纸部分,该部分为检测反应过程提供层析动力。胶体金免疫层析试纸条具体结构分布如图1.3.1所示。
胶体金免疫层析试纸条定性检测原理可分为两大类:竞争法和非竞争法。非竞争法又可分为夹心法和间接法。如图1.3.2: (A)竞争法检测原理 (B)夹心法检测原理 (C)间接法检测原理【2】。
胶体金免疫层析试纸是一种快速免疫分析技术。胶体金免疫层析技术应用广泛,在市场上的应用包括病原体抗原与抗体的检测,激素或相关蛋白等生化指标的检测,食品安全的检测等。金标免疫层析技术与同位素、荧光、化学发光等其他标记方法相比,配置试剂简单,不需要进行结合标记物的分离,省去了繁琐的添加样品、洗涤等步骤。其显色速度快,目测就可以进行定性判断。但是并不代表金标免疫层析技术就只能定性而完全不可以定量,根据光电检测原理,可以将试纸条的颜色变化转化成电信号,通过传感器技术检出电信号的数值,从而也能定量检测出金标纸条的样品浓度。
目前国家药监局已批准24个新冠病毒抗原检测试剂产品,其中大部分是基于胶体金法,见图1.4。其中获证的少数产品是乳胶法和荧光免疫层析法,3种方法采用了三种不同的标记物,胶体金法和乳胶法的特点在于不需使用特殊仪器,肉眼即可判断,并且操作简便、检测时间短,其中乳胶法的显色能力更强,结果显示更直观。荧光免疫层析法相较于胶体金法、乳胶法而言灵敏度更高,但在使用的时候均需要配套的荧光检测器,目前没有居家使用型,仪器价格高。另外,荧光微球的成本较之于胶体金、乳胶高,可及性偏差(关于标记物知识 可学习以下链接:新冠病毒抗原检测试剂3大标记物对比,存在哪些差异)。
新冠病毒是一种内含核酸、外披包膜的简单生命体,在包膜上还有标识着病毒“身份”的蛋白。当机体发现“敌情”,也就是识别出病毒的蛋白后,会启动一系列免疫反应产生抗体。新冠病毒抗原检测其实就是检测病毒蛋白。胶体金则是一种胶体形式的金标记生物大分子,在检测新冠病毒抗原的过程中,可以作为一种显色媒介与抗体结合在一起,这样就相当于给抗体染了色,原本肉眼看不到的抗体就能被观察到。
胶体金法新冠病毒抗原检测试剂盒的基本原理其实就是“抗原—抗体反应”。抗原和抗体就如同“钥匙和锁”的关系,当机体免疫系统识别出病毒抗原后产生抗体,抗体进一步与病毒抗原发生特异性结合,并且这种特异性结合在体外也能发生,这就为研制抗原检测试剂盒增加了“可行性”。
层析试纸条检测核酸,准确的说是利用免疫层析技术来检测样本中核酸扩增后的核酸产物或者反应体系的信号产物。
如图2.2,CRISPR产物检测试纸条应用了夹心法免疫层析的原理,胶体金上标记了特异性的FITC单抗,NC膜的检测线(T线)上固定了链霉亲和素(SA),NC膜的质控线(C线)上固定了二抗。当样本中存在一定量的FAM-生物素(或FITC-生物素)双标记探针,其与胶体金形成胶体金-FITC单抗-FAM-生物素的聚合物,该聚合物在T线被捕获,从而T线显色,C线捕获标记有FITC单抗的胶体金而显色;当靶标分子存在,Cas蛋白受到激活发生非特异的ssDNA切割,双标记探针被降解,胶体金-FITC单抗-FAM的聚合物不能被T线捕获,则T线不显色,C线仍可捕获标记有FITC单抗的胶体金而显色。
而市面的核酸试纸条的检测技术除了检测CRISPR产物之外,还可以检测PCR、LAMP和RPA等目的基因的扩增产物,主要是上下游引物分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素,核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素及抗荧光素抗体。在扩增产物与扩展液混合后点在试纸条上时,当有扩增产物时,产物上修饰的生物素与金标上修饰的异硫氰酸荧光素的胶体金结合,到达检测线时,线上的抗荧光素抗体将标有荧光素的产物捕获,从而显色。
由SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行目前构成了一场紧迫的全球医疗危机,为此POCT应运而生,胶体金抗原检测虽然快,但是不能取代核酸检测,抗原检测适合早筛,而新冠诊断的判定标准还是核酸检测。如何做能做到大批量自我筛查新冠病毒的核酸分子显得非常重要,特别是资源有限的地区需要简单易普及的检测解决方案来控制疫情的蔓延。
引文[3]文献中,作者开发了一种微流控集成侧流重组酶聚合酶扩增(MI-IF-RPA)测定法,用于快速灵敏地检测SARS-CoV-2,它将逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)和通用侧流(LF)试纸检测系统集成到单个微流控芯片中,实现简单且快速检测新冠病毒的核酸分子。如图3.1.1。
对于每个样品,将200μL电泳缓冲液(缓冲液C)转移到芯片上的右侧入口孔中。然后,将13.5μLRT-RPA反应缓冲液(缓冲液A),30μL提取的RNA和4μL引物(2μM)转移到冻干的RT-RPA试剂和酶中。然后将RT-RPA反应混合物通过芯片上的左侧入口孔转移到反应储液器中,然后转移到2.5μL的280 mM MgOAc中;
孵育后,芯片直立放置,只需摇动,以确保扩增产物和电泳缓冲液充分混合。然后将芯片保持在直立位置2-5分钟,同时反应混合物流经底部的混合室并进入横向流腔以读取信号。扩增产物(阳性结果)的存在由彩色测试线的外观表示。由于存在未结合的金标记抗FAM抗体,测试线上方出现单独的对照线,表明试纸条功能正常(图3.1.2)【3】。
Detect Covid-19 Starter Kit产品采用RT-LAMP技术和免疫层析技术结合的方式,同时具有PCR试剂的灵敏度和抗原快筛试剂的简便快速的特点,官网售价是85美元一套。检测时间包括等温扩增55min+层析显色10min,合计操作一次自测新冠耗时大概1.5h以内。和抗原快筛试剂相比,Detect公司的试剂可以显著提高灵敏度,可以在病毒浓度更低的时候检测出来,有利于早期检测和发现无症状患者。和传统的PCR试剂相比,它不需要实验室的参与,可以在家庭环境中使用,而且只需要不到1.5小时就可以出结果。
Detect Covid-19这个产品的设计特点,如图3.2.2可见,产品设计的思路是将样本到扩增产物放在塑料管子中实现,然后另外设计了加热装置和层析显色卡,智能手机app提供结果判定,根据不用结果给出分析到客户端。
其实无论是胶体金免疫层析的抗原检测,还是核酸扩增+免疫层析显色,或者试剂原料端直接让产物实现显色判定阴阳性,这些都是因为新冠疫情传播特别快的背景,需要快速实现阳性样本的筛查,所以需要有这方面的创新技术,以尽可能快速的遏制新冠疫情的蔓延。但是我们都知道,免疫层析或者等温扩增技术都是对样本的检测限都一定要求,而且临床的阳性符合率是不能和PCR技术达到同一水平的。临床病原体确诊的金标准依然还是PCR技术,更准确的说是实时荧光定量PCR技术,抛开新冠的影响,我们对于产品的要求,是需要更符合大市场环境的需求,而微流控芯片和PCR、dPCR技术的结合具备足够的优势。
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