是一种以高血糖、胰岛素抵抗和低度炎症为特征的慢性代谢性疾病,可导致脑血管疾病、糖尿病肾病等严重并发症。T2DM被认为是由饮食不当或不健康、缺乏运动、吸烟和肥胖引起的。随着经济的发展和人们生活质量的提高,T2DM的发病率在世界范围内逐渐增加。根据国际糖尿病联合会2021年发布的数据,全球2型糖尿病患者已达5.37亿人,预计到2030年将增至6.43亿人。因此,加强T2DM研究体系建设,促进T2DM防控机制的建立,已成为科学研究的重要目标。
大量证据表明,肠道菌群失调与糖尿病的发生发展密切相关。肠道菌群的结构变化可引起细菌动态失衡,增加革兰氏阴性菌的丰度,从而产生内毒素。此外,高水平的内毒素可与toll样受体4 (TLR4)结合,激活核因子κb (NF-κB)通路,释放破坏肠道屏障完整性的细胞因子,导致细菌内毒素渗漏到门静脉循环,引发全身慢性炎症反应,从而导致胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常。同时,肠屏障的不完整可启动肠粘膜内的致糖尿病胰岛反应性T细胞,促进自身免疫性糖尿病的发生。
粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指将健康供体粪便滤液植入受体肠道,重建肠道菌群,治疗肠道菌群失衡疾病。许多证据表明,FMT在治疗T2DM中起着重要作用,因为FMT可以恢复健康的肠道屏障,从而延缓糖尿病的发展。同时,也有报道表明,FMT可以改善肠道菌群组成,保护肠道屏障。这些结果表明,FMT在修复肠道微生物群紊乱引起的肠道屏障损伤中起着重要作用。
食用菌因其丰富的营养和药用价值,越来越受到研究者的重视。蛹虫草在东亚国家作为传统药物和功能食品被广泛使用了几个世纪。其中蛹虫草多糖的含量最为丰富,有报道称蛹虫草多糖具有多种生物活性,如降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降糖和抗炎等。我们之前的研究表明,蛹虫草的酸提取多糖(AEPS)可以改善HFD和stz诱导的T2DM的症状。然而,对其抗糖尿病作用的机制尚未深入研究。已有研究证实,蛹虫草多糖在上消化道不被降解吸收,不易消化的多糖可能被肠道菌群分解而发挥作用。
饮食干预6周后,所有小鼠禁食不禁水12h。糖尿病组在72h内腹腔注射60 mg/kg柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 4.5) STZ溶液2次,NC组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。观察2周后,用血糖仪测定各组小鼠的空腹血糖(FBG),FBG水平≥11.1 mmol/L的小鼠作为T2DM小鼠。然后,将所有T2DM小鼠随机分为两组,模型对照组(MC,n = 10)和AEPSa治疗组(n = 10)。AEPSa治疗组小鼠给予AEPSa 400 mg/kg/ d, NC组和MC组小鼠给予相同体积的PBS,每天灌胃1次,持续6周。试验期间,每周记录摄水量和摄食量,在8、9、11、13、14周分别测定5次空腹血糖。在治疗的最后一周,收集所有小鼠的粪便。整个实验持续14周。实验结束时,在戊巴比妥钠下处死小鼠。从眼眶采血,迅速切除结肠、肝脏、肾脏和胰腺。收集的样品用于进一步测试。
血清相关指标分析:取血清(2000 rpm, 10 min),按照试剂盒说明检测总胆固醇(TC)、三酯(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、空腹血清胰岛素(FINS)、脂联素(ADP)、瘦素(LEP)、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)和脂多糖(LPS)。胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA- IR)按下式计算:
口服葡萄糖耐量试验(OGGT):AEPSa 治疗6周后,进行OGTT。小鼠以2 g/kg葡萄糖溶液灌胃,并在0、30、60、90和120 min时测定血糖水平。
结肠炎性细胞因子分析:采用ELISA试剂盒检测结肠肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6。
组织病理学分析:固定结肠、肝、肾、胰腺5μm切片,修整、洗涤、脱水、清理、切片,脱蜡成水,苏木精和伊红染色,中性树脂贴装。最后,在显微镜下观察染色切片并拍照。
FMT对T2DM小鼠症状及肠道屏障的影响:FMT实验验证了肠道菌群与AEPSa 介导的调节之间的因果关系。NC组和AEPSa组小鼠在13周和14周收集粪便,保存于-80℃冰箱中,在无菌条件下低温溶解于无菌生理盐水(100 mg/1 mL)中,离心(1000 rpm, 1 min, 4℃),得到粪便微生物富集液。
AEPS的纯化:收集一种中性多糖(AEPSa),用DEAE-52色谱法用去离子水洗脱(图1A)。采用Sephadex G-100层析对AEPSa进行纯化,得到精制AEPSa。纯度测试表明,洗脱曲线B),说明AEPSa为均相化合物。
同质性和MW检验:根据HPGPC曲线 min时出现了一个对称的宽峰,说明AEPSa为均相化合物,与纯化结果一致,其Mw为87.8 kDa。
单糖组成:HPLC图谱如图1E和F所示,与标准单糖的保留时间相比,AEPSa由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,摩尔比为2.2:15.1:1。
如图3C、D所示,与NC组相比,MC组AST、ALT活性显著升高(P 0.05),说明长期给药HDF/STZ引起肝损伤,而AST、ALT异常变化明显改善(P 0.05)。同时,肝脏组织病理学图像如图3G所示。NC组小鼠肝脏切片显示肝脏结构正常,肝细胞排列规则,而MC组表现为核萎缩,细胞边界模糊,肝细胞大量坏死,肝细胞肿胀,分散的水泡性脂肪变性和空泡变性。然而,口服AEPSa可明显改善这些异常变化。结果表明,AEPSa可减轻HDF/STZ所致肝损伤。
如图3E和F所示,与NC组相比,MC组BUN和Cr水平显著升高(P 0.05),说明T2DM小鼠肾功能受损,而补充AEPSa可显著抑制BUN和Cr的升高。同时,肾脏组织病理学图如图3H所示。NC组小鼠肾切片显示肾小球及周围结构正常,而MC组肾损伤表现为肾小球肿胀、肾小球囊间隙变宽、肾小球边界不明。然而,AEPSa干预明显改善了这些异常变化。
胰腺的组织病理学图像如图3I所示。NC组胰岛结构正常,呈卵形细胞团,边界清晰,胰腺内各细胞排列规则,细胞核清晰。反之,严重的胰岛损伤表现为胰岛结构异常,边界不清,萎缩。经AEPSa干预后,病理改变均有不同程度缓解。
F图4A-D显示,与NC组相比,MC组Claudin1、Occludin和ZO-1的表达水平显著下调(P 0.05),仅为NC组的56.47%、59.36%和66.03%,说明T2DM小鼠肠道屏障受到损伤。然而,AEPSa明显上调了Claudin1、Occludin和ZO-1的表达,表明AEPSa在一定程度上恢复了T2DM小鼠的肠道屏障。结肠的组织病理学图像如图4E所示。NC组小鼠结肠切片显示结肠上皮完整,隐窝结构排列有序,杯状细胞分布均匀,而MC组结肠损伤表现为明显的炎症浸润,杯状细胞减少,隐窝紊乱,隐窝分支萎缩。经AEPSa干预后,上述病理改变均有不同程度缓解。
与NC组比较,MC组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4蛋白表达水平及NF-κBp65、i -κBα磷酸化水平均显著升高(P0.05),说明TLR4/NF- κB通路被激活,T2DM小鼠结肠组织发生炎症反应,与结肠组织病理变化相似。然而,AEPSa干预后,TNF-α、IL-1β、IL-6和TLR4蛋白表达的变化以及NF-κB p65和i-κB α的磷酸化被明显逆转。上述结果提示AEPSa可抑制TLR4/NF-κB通路,缓解结肠炎症的发展,结肠组织病理学观察证实了这一结论。
主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)显示,NC组和MC组肠道菌群组成的聚类结果明显不同(图6C和D)。添加AEPSa后,MC组和AEPSa组肠道菌群组成的聚类结果明显分离(图S6)。OTU层次聚类树的结果与PCA和PCoA相似。β多样性分析表明,AEPSa可调节T2DM小鼠肠道菌群。
在门水平上,评估了多组之间的差异(图6H-J)。拟杆菌门, 弯曲杆菌和脱铁杆菌群之间的差异最为显著NC、MC和AEPSa组(P0.05)。与NC组相比拟杆菌、弯曲杆菌和大肠杆菌的相对丰度细菌显著减少(P0.05)。然而,AEPSa支持的相对丰度明显增加拟杆菌门和弯曲菌门(P0.05)。这些结果表明在门水平。
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